自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用
Summary
该协议描述了如何使用最近为标准体外电生理设备开发的系统进行自动图像引导的膜片钳实验。
Abstract
全细胞膜片钳是衡量单细胞电性质的金标准方法。然而，由于其复杂性和对用户操作和控制的高度依赖，体外膜片钳仍然是具有挑战性和低吞吐量的技术。该手稿展示了一种用于急性脑切片体外全细胞膜片钳实验的图像引导自动膜片钳系统。我们的系统实施基于计算机视觉的算法来检测荧光标记的细胞，并使用显微操纵器和内部移液管压力控制将其定位成全自动修补。整个过程是高度自动化的，对人为干预的要求最低。实时的实验信息，包括电阻和内部移液器压力，以电子方式进行记录，以便将来进行分析和优化到不同的细胞类型。虽然我们的系统是在急性文胸的背景下描述的n切片记录，还可以应用于解离神经元，器官切片培养物和其他非神经元细胞类型的自动图像引导膜片钳。
Introduction
Neher和Sakmann于20世纪70年代首先研发了膜片钳技术，研究了可兴奋膜1的离子通道。从那时起，斑块夹紧已被应用于细胞，突触和电路水平的许多不同受试者的体外和体内研究 – 在许多不同的细胞类型，包括神经元，心肌细胞，非洲爪蟾卵母细胞和人造脂质体2 。该过程涉及正确识别和靶向感兴趣的细胞，复杂的显微操纵器控制将贴片移液管移动到细胞附近，在适当的时间向移液管施加正压和负压以建立紧密的基底膜，并建立一个全单元补丁配置。贴片钳通常手动进行，需要大量培训才能掌握。即使是经验丰富的研究人员钳夹，成功率相对较低。最近，已经进行了几次尝试来实现膜片钳实验的自动化。两个主要策略已经发展到完成自动化：增加标准膜片钳设备，从头开始自动控制修补过程和新设备和技术的设计。前者的策略是适用于现有的硬件，并且可以在各种膜片钳应用中使用，包括在体内盲膜片钳3，4，5， 体外急性脑切片的膜片钳，器官切片培养物中，培养解离的神经元6 。它可以同时使用多个显微操纵器来询问复杂的局部电路7 。平面贴片方法是新开发策略的一个例子，可以实现高吞吐量同时p用于药物筛选目的的悬浮液中的细胞的atch夹钳8 。然而，平面贴片方法不适用于所有细胞类型，特别是具有长过程的神经元或包含广泛连接的完整电路。这限制了其应用来映射神经系统的复杂电路，这是传统膜片钳技术的关键优势。
我们开发了一种通过增加标准膜片钳硬件在体外自动化手动膜片钳制程的系统。我们的系统Autopatcher IG提供自动移液器校准，荧光细胞靶标识别，移液管移动自动控制，自动全细胞修补和数据记录。该系统可以自动获取不同深度的脑片的多个图像;使用计算机视觉分析他们;并提取信息，包括荧光标记细胞的坐标。那么这个信息就可以了用于目标和自动补丁感兴趣的细胞。该软件是使用Python编写的，这是一种免费的开源程序设计语言，它使用几个开源库。这确保了其他研究人员的可及性，并提高了电生理实验的重现性和严谨性。该系统具有模块化设计，使得额外的硬件可以轻松地与当前演示的系统进行接口。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了体外自动图像引导膜片钳记录的方法 。这个过程的关键步骤总结如下。首先，计算机视觉用于使用通过显微镜获取的一系列图像来自动识别移液管尖端。然后将该信息用于计算显微镜和机械手坐标系之间的坐标变换函数。计算机视觉用于自动检测荧光标记的细胞并识别其坐标。这些步骤集成了移液器瞄准和使用开源Python编程语言PyQT和OpenCV库的自动修补算法。
…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢Whitehall基金会的财政支持。我们要感谢萨缪尔·基辛格的宝贵意见。
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
Riferimenti
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
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- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
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- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
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- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
