Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro
Summary
Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .
Abstract
O grampo de patch de células inteiras é o método padrão de ouro para medir as propriedades elétricas de células isoladas. No entanto, o grampo de patch in vitro continua a ser uma técnica desafiadora e de baixo débito devido à sua complexidade e alta dependência da operação e controle do usuário. Este manuscrito demonstra um sistema de grampo de correção automático guiado por imagem para experiências in vitro de grampos de grampos de células inteiras em fatias agudas do cérebro. Nosso sistema implementa um algoritmo baseado em visão computacional para detectar células marcadas com fluorescência e direcioná-las para o patch totalmente automático usando um micromanipulador e controle de pressão interna da pipeta. Todo o processo é altamente automatizado, com requisitos mínimos para a intervenção humana. As informações experimentais em tempo real, incluindo a resistência elétrica e a pressão interna da pipeta, são documentadas eletronicamente para análise futura e para otimização para diferentes tipos de células. Embora o nosso sistema seja descrito no contexto do brai agudoN grava gravações, também pode ser aplicada à braçadeira automatizada de patch guiada por imagem de neurônios dissociados, culturas de fatias organotípicas e outros tipos de células não neuronais.
Introduction
A técnica de grampos de parches foi desenvolvida pela primeira vez por Neher e Sakmann na década de 1970 para estudar os canais iônicos de membranas excitáveis 1 . Desde então, o aperto de patch foi aplicado ao estudo de vários assuntos diferentes a nível celular, sináptico e de circuito – tanto in vitro como in vivo – em vários tipos de células diferentes, incluindo neurônios, cardiomiócitos, oócitos Xenopus e lipossomas artificiais 2 . Este processo envolve a identificação correta e a segmentação de uma célula de interesse, o controle intrincado de micromanipulador para mover a pipeta de remendo próxima à célula, a aplicação de pressão positiva e negativa para a pipeta no momento adequado para estabelecer um patch gigaseal apertado, E uma invasão para estabelecer uma configuração de patch de células inteiras. O aperto do patch normalmente é conduzido manualmente e requer treinamento extensivo para dominar. Mesmo para um pesquisador com o patchClamp, a taxa de sucesso é relativamente baixa. Mais recentemente, várias tentativas foram feitas para automatizar experiências de patch-clamp. Duas estratégias principais evoluíram para realizar a automação: aumentando o equipamento padrão de grampo de patch para fornecer controle automático do processo de correção e o design de novos equipamentos e técnicas desde o início. A estratégia anterior é adaptável ao hardware existente e pode ser usada em uma variedade de aplicações de grampos patch, incluindo grampos de patch cegos in vivo 3 , 4 , 5 , grampo de patch in vitro de fatias de cérebro agudo, culturas de fatia organotípicas e neurônios dissociados cultivados 6 . Ele permite a interrogação de circuitos locais complexos usando múltiplos micromanipuladores simultaneamente 7 . O método de patch planar é um exemplo da nova estratégia de desenvolvimento, que pode atingir o alto desempenho simultâneo pBraçadeira de grampo de células em suspensão para fins de triagem de drogas 8 . No entanto, o método de patch plano não é aplicável a todos os tipos de células, particularmente neurônios com processos longos ou circuitos intactos contendo conexões extensas. Isso limita sua aplicação ao mapeamento dos intrincados circuitos do sistema nervoso, que é uma vantagem fundamental da tecnologia tradicional de grampos de patch.
Desenvolvemos um sistema que automatiza o processo de grampeamento manual in vitro , aumentando o hardware padrão de grampos de parafusos. Nosso sistema, Autopatcher IG, fornece calibração automática de pipeta, identificação de alvo de célula fluorescente, controle automático de movimento de pipeta, patches automáticos completos e registro de dados. O sistema pode adquirir automaticamente múltiplas imagens de fatias de cérebro em diferentes profundidades; Analise-os usando a visão por computador; E extrair informações, incluindo as coordenadas de células com marcação fluorescente. Esta informação pode então serUsado para segmentar e corrigir automaticamente células de interesse. O software está escrito em Python – uma linguagem de programação livre e de código aberto – usando várias bibliotecas de fonte aberta. Isso garante a sua acessibilidade a outros pesquisadores e melhora a reprodutibilidade e o rigor das experiências de eletrofisiologia. O sistema possui um design modular, de modo que o hardware adicional pode ser facilmente interagido com o sistema atual demonstrado aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um método para gravações automáticas de grampos de patch guiados por imagem in vitro . Os passos principais neste processo estão resumidos da seguinte forma. Primeiro, a visão computacional é usada para reconhecer automaticamente a ponta da pipeta usando uma série de imagens adquiridas através de um microscópio. Esta informação é então utilizada para calcular a função de transformação de coordenadas entre o microscópio e os sistemas de coordenadas do manipulador. A visão co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Whitehall. Gostaríamos de agradecer Samuel T. Kissinger pelos valiosos comentários.
Materials
| CCD Camera | QImaging | Rolera Bolt | |
| Electrophysiology rig | Scientifica | SliceScope Pro 2000 | Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”. |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | computer-controlled microelectrode amplifier |
| Digitizer | Molecular Devices | Axon Digidata 1550 | |
| LED light source | Cool LED | pE-100 | 488nm wavelength |
| Data acquisition board | Measurement Computing | USB1208-FS | Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf |
| Solenoid valves | The Lee Co. | LHDA0531115H | |
| Air pump | Virtual industry | VMP1625MX-12-90-CH | |
| Air pressure sensor | Freescale semiconductor | MPXV7025G | |
| Slice hold-down | Warner instruments | 64-1415 (SHD-40/2) | Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm |
| Python | Anaconda | version 2.7 (32-bit for windows) | https://www.continuum.io/downloads |
| Screw Terminals | Sparkfun | PRT – 08084 | Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin) |
| (2-Pin) | |||
| N-Channel MOSFET 60V 30A | Sparkfun | COM – 10213 | |
| DIP Sockets Solder Tail – 8-Pin | Sparkfun | PRT-07937 | |
| LED – Basic Red 5mm | Sparkfun | COM-09590 | |
| LED – Basic Green 5mm | Sparkfun | COM-09592 | |
| DC Barrel Power Jack/Connector (SMD) | Sparkfun | PRT-12748 | |
| Wall Adapter Power Supply – 12VDC 600mA | Sparkfun | TOL-09442 | |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | Sparkfun | PRT-11367 | |
| Locking Male x Female X Female Stopcock | ARK-PLAS | RCX10-GP0 | |
| Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings | Fisher scientific | 14-171-129 | Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in. |
| BNC male to BNC male coaxial cable | Belkin Components | F3K101-06-E | |
| 560 Ohm Resistor (5% tolerance) | Radioshack | 2711116 | |
| Picospritzer | General Valve | Picospritzer II |
Riferimenti
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
- Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
- Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
- Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
- Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
- Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630 (2013).
- Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
- Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
- Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).
