استخدام رقاقة حاسة الشم تكييف موائع جزيئية لتصوير نشاط الخلايا العصبية في الرد على الفيرومونات في الذكور ايليجانس جيم رئيس الخلايا العصبية
Summary
يتم وصف استخدام تكييف “رقاقة حاسة الشم” لتصوير الكالسيوم كفاءة الذكور C. ايليجانس هنا. وترد أيضا دراسات التعرض الذكور والغليسيرول وفرمون.
Abstract
استخدام مؤشرات الكالسيوم عزز إلى حد كبير فهمنا لديناميات العصبية والتنظيم. ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس، مع الجهاز العصبي تماما المعينة والتشريح شفافة، يقدم نموذجا مثاليا لفهم ديناميات العصبية في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات الكالسيوم. في تركيبة مع التكنولوجيات موائع جزيئية وتصاميم تجريبية، يتم تنفيذ دراسات الكالسيوم-التصوير باستخدام هذه المؤشرات في الحيوانات التحرك الحر والمحاصرين. بيد أن معظم الدراسات السابقة استخدام الأجهزة الملائمة، مثل رقاقة حاسة الشم الموصوفة في Chronis et al.، الأجهزة المصممة للاستخدام في خنثي أكثر شيوعاً، كما ذكر أقل شيوعاً على حد سواء شكلياً وهيكليا متباينة. رقاقة إلكترونية حاسة الشم تكييف صمم وملفقة لزيادة الكفاءة في تصوير الخلايا العصبية الذكور مع استخدام الحيوانات البالغين الشباب. قد أدرجت بدوره الدودة تحميل المنفذ لتدوير الحيوانات والسماح لفصل الخلايا العصبية الفردية داخل زوج ثنائية في 2D التصوير. الديدان تتعرض لمراقبة تدفق الرائحة داخل الجهاز موائع جزيئية، كما هو مبين في الدراسات السابقة خنثي. ويتم تحليل العابرين الكالسيوم ثم استخدام البرمجيات المفتوحة المصدر إيماجيج. يجب السماح الإجراء الموضح هنا لزيادة كمية المستندة إلى ذكر C. ايليجانس الكالسيوم التصوير الدراسات، تعميق فهمنا لآليات الإشارات العصبية الخاصة بالجنس.
Introduction
توفر أجهزة موائع جزيئية زيادة الوصول إلى البيئات التي تسيطر عليها تحديداً، حيث الحيوانات، مثل ديدان أسطوانية C. ايليجانس، يمكن أن يكون تجريبيا التلاعب1. وتشمل هذه الدراسات فحوصات السلوكية، ودراسات التصوير الكالسيوم، أو عروض حتى لتعمل محددة، أسفر عن قياسات أكثر دقة للنتائج التجريبية1،2،،من34، 5،6. ميكروفلويديكس توفير ظروف السائل صغيرة يمكن من خلالها تشغيل التجارب التفصيلية بينما تستخدم كميات ضئيلة من الكواشف. هناك إنتاج مستمر لتصميمات الجهاز موائع جزيئية جديدة، ويختلف استخدام كل من الساحات التي تسمح للحركة الجيبية الطبيعية من C. ايليجانس في فحوصات السلوكية والعصبية دراسات التصوير، إلى اعتراض الأجهزة المستخدمة في التصوير العصبية ودراسات حاسة الشم، إلى الأجهزة التي تسمح لتحليل المظهرية الفائق في الوراثية شاشات4،5،،من67. عقب تلفيق العفن الرئيسية، أجهزة موائع جزيئية غير مكلفة لبناء – نظراً لإعادة استخدام الرئيسي – وسهلة الاستخدام، مما يسمح لتوليد البيانات بسرعة عن طريق دراسات الفائق. تصنيع الأجهزة باستخدام البوليمرات مثل بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) يسمح بإنشاء أجهزة جديدة في غضون ساعات.
استخدام دراسات التصوير الكالسيوم الكالسيوم وراثيا المرمزة المؤشرات (جيسيس) أعربت في الخلايا الهدف لقياس ديناميات العصبية من تلك الخلايا في الوقت الحقيقي8،9،،من1011. طبيعة شفافة C. ايليجانس يسمح لتسجيل مستويات هذه البروتينات في الحيوانات الحية الفلورسنت. تقليديا، جيسيس تعتمد على البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-على أساس الاستشعار بروتينات فلورية خضراء-كالمودولين-M13 “الببتيد” (جكامب)، على الرغم من أن الدراسات الأخيرة قد تكيفت هذه المجسات للسماح لأفضل إشارة إلى الضوضاء النسب وملامح الإثارة تحول الأحمر. بعد وضع GCaMP3، قد اختلفت البروتينات بتلك المواصفات، بما في ذلك أجهزة الاستشعار مثل GCaMP6s و GCaMP6f (بطيئة وسريعة fluorescence قبالة-معدلات، على التوالي)، فضلا عن طلب تقديم العروض-كالمودولين-M13 “الببتيد” (ركامب)، التي قد تحول الأحمر تفعيل الشخصية. المزيج من هذه جيسيس مع C. ايليجانس الجينات الخاصة بخلية المروج تسلسل يمكن استهداف الخلايا ذات الاهتمام، والخلايا العصبية الحسية وبخاصة12،13،،من1415 , 16.
بينما يتضح سهولة الاستخدام C. ايليجانس في الدراسات موائع جزيئية، وتقريبا جميع الدراسات ركزت على المنحرفين. وعلى الرغم من الذكور فقط تمثل 0.01-0.02% من السكان نوع البرية، يمكن أن تنشأ نتائج لا تقدر بثمن من تكييفها. بينما تم تعيين الشبكة العصبية المادية للجهاز العصبي خنثي بالكامل لعقود17، ما زالت عصبية الذكور غير مكتملة، لا سيما في منطقة الرأس من الحيوان18. استخدام تصوير الكالسيوم في الذكور سيساعد على توليد فهم في الجهاز العصبي الذكور والخلافات التي تنشأ بين الجنسين. حجم أصغر من الذكور البالغين C. ايليجانس يمنع تعويض فعالة وموثوق بها في موانئ تحميل أجهزة الشم التقليدية مصممة للمنحرفين أكبر. لمعالجة هذا الوضع، نسخة معدلة من رقاقة حاسة الشم Chronis19 تم تطويره باستخدام منفذ تحميل أضيق، ارتفاع قناة الدنيا، ويتحول في دودة ميناء التحميل (التي تدوير الحيوان)، مما يسمح للتصور من الثنائية يسار/يمين أزواج الخلايا العصبية. يسمح هذا التصميم: (1) تعويض فعالة من الشباب الذكور البالغين، (2) اتجاه أكثر موثوقية من الحيوان للتصور من كل أعضاء الخلايا العصبية الاقتران الثنائي، و (3) التصوير الدقيق للنشاط العصبي في الخلايا العصبية الذكور.
متزايدة، تشير الدراسات إلى أن الذكور C. ايليجانس يستجيب بطريقة مختلفة عن المنحرفين لمجموعة متنوعة من أسكاروسيديس (عسكر)، أو ديدان أسطوانية الفيرومونات20،،من2122،23 ،24. ولذلك، أصبح تطوير فهم ديناميات العصبية والتمثيل داخل الشبكة العصبية الذكور حتى أكثر صلة بالموضوع. الذكور C. ايليجانس تحتوي على 87 من الخلايا العصبية الخاصة بالجنس غير موجود في خنثي25،26، تغيير الشبكة العصبية في وصفها-طرق لم يحدد حتى الآن. التمكن من صورة هذه الديناميات العصبية فريدة من نوعها سوف تسمح لنا بفهم أفضل للردود الخاصة بالجنس وتمثيلات العصبية.
يصف هذا البروتوكول استخدام شريحة حاسة الشم أنثى-تكييفها لتصوير العصبية من الذكور C. ايليجانس تشيموسينسيشن. الدراسات العصبية nociceptive الرماد يستجيب موثوق والغليسيرول 1 م في الذكور، وتتفق مع السابقة hermaphroditic27. التعرض إلى أسكاروسيديس يمكن الحصول على ردود التي متغير من الحيوان للحيوان، التي تتطلب عددا أكبر من الحيوانات لفحصها. سابقا قد تبين استجابة الخلايا العصبية جيم خاصة بالذكور، من خلال الكهربية والكالسيوم التصوير الدراسات، الاستجابة مغايرة أسكاروسيدي #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
رقاقة حاسة الشم تتكيف مع ذكر يتضمن بدوره إلى ميناء تحميل أضيق، مما يسمح للمزيد من السيطرة التوجه وتعويض فعال للذكور C. ايليجانس. وهذا يسمح للتصور من كل من أعضاء اليسار واليمين من أزواج ثنائية الخلايا العصبية، دون الحاجة إلى التراص z. يؤدي هذا المنحنى إلى توجه بعيداً عن رأسي 100% من الوقت ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر زيمر مانويل لتزويدنا بملف التصميم الأولية التي تم تكييفها للاستخدام مع الذكور؛ فرانك شرودر للتوليف وإمدادات من عسكر #3؛ لاجوي روس للبصيرة والمساعدة مع التصوير والتحليل؛ ولورا أوريليو لتصنيع الرئيسي ومنظمة الصحة العالمية، جنبا إلى جنب مع كريستوفر المشغلة، ساهمت في استعراض هذه المخطوطة. تم توفير التمويل لهذا العمل ضمن “المعاهد الوطنية للصحة” منحة 1R01DC016058-01 (ج. س.) ومنح المؤسسة الوطنية للعلوم كبة 1605679 (D.R.A.)، و “جائزة الوظيفي ويلكوم بوروز” في واجهة العلمية (D.R.A.).
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
Riferimenti
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
