Использование адаптированных Microfluidic обонятельных чип для отображения активности нейронов в ответ на феромоны в мужской C. Elegans головы нейронов
Summary
Здесь описывается использование адаптированных «обонятельных чип» для эффективного кальция изображений самцы нематоды Caenorhabditis elegans . Отображаются также исследования мужской воздействия глицерина и феромонов.
Abstract
Использование кальция показателей позволило значительно расширить наше понимание динамики нейронной и регулирования. Нематоды Caenorhabditis elegans, с его полностью сопоставленных нервной системы и прозрачной анатомии, представляет идеальная модель для понимания реального времени нейронных динамики, с использованием показателей кальция. В сочетании с microfluidic технологий и экспериментальных проектов кальций томографии исследования с использованием этих показателей выполняются бесплатно перемещение и захваченных животных. Однако большинство предыдущих исследований с использованием треппинга устройств, таких как обонятельные чип, описанные в Chronis et al., иметь устройства, предназначенные для использования в более общих гермафродита, как менее распространенные мужчины как морфологически и структурно разнородных. Адаптированный обонятельных чип был разработаны и изготовлены для повышения эффективности в мужской нейрональных изображений с использованием молодых взрослых животных. Очередь была включена в червь, Загрузка порт для поворота животных и для разделения отдельных нейронов в рамках двусторонних пара в 2D изображения. Черви подвергаются контролируемого потока одоранта в пределах microfluidic устройство, как описано в предыдущих исследованиях Гермафродит. Кальция транзиентов затем анализируются с помощью программное обеспечение open-source ImageJ. Описываемую процедуру следует предусмотреть увеличение количества на основе мужской C. elegans кальция изображений исследования, углубления нашего понимания механизмов конкретного пола нейрональных сигнализации.
Introduction
Microfluidic приборы обеспечивают расширение доступа к точно контролируемой среде, которой животных, такие как нематоду C. elegans, могут быть экспериментально манипулировать1. Эти исследования включают поведенческих анализов, кальция изображений исследования или даже показы для конкретных фенотипов, что приводит к более точные измерения экспериментальных результатов1,,2,3,,4, 5,6. Микрофлюидика обеспечивают мелкие жидких условия, через которые можно запускать подробные эксперименты во время используя минимальное количество реагентов. Существует постоянное производство новых microfluidic устройство конструкций, и использования каждого колеблется от арены, которые позволяют для естественного синусоидальные движения C. elegans в поведенческих анализов и нейронных обработки изображений исследования, в ловушку устройств, используемых в нейронных изображений и обонятельные исследования, для устройств, которые позволяют для фенотипического анализа высок объём в генетических экранов4,5,6,7. После изготовления мастер плесень, microfluidic приборы стоят недорого построить — учитывая многократного использования мастера — и простой в использовании, что позволяет для создания быстрого данных через высок объём исследований. Изготовление устройств с использованием полимеров, таких как полидиметилсилоксан (PDMS) предусматривает создание новых устройств в течение часа.
Кальция изображений исследования использовать генетически закодированный кальция индикаторов (GECIs) в клетки-мишени для измерения нейронных динамику этих клеток в реальном времени8,9,10,11. Прозрачный характер C. elegans позволяет для записи флуоресцентные уровней этих белков в живых животных. Традиционно, GECIs полагаются на Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)-на основе датчика GFP-Кальмодулин-M13 пептида (GCaMP), хотя более недавние исследования адаптировали эти датчики для лучшего соотношения сигнал шум и красно смещается возбуждения профилей. После разработки GCaMP3, имеют различные белки с этим спецификациям, включая датчики, например GCaMP6s и GCaMP6f (медленно и быстро флуоресценции вне цены, соответственно), а также ППП-Кальмодулин-M13 пептида (RCaMP), который имеет красно перенесен Активация профиля. Сочетание этих GECIs с C. elegans клеток конкретных генов промоутер последовательности можно ориентировать клетки интереса, особенно сенсорных нейронов12,13,14,15 , 16.
Хотя простота использования C. elegans в microfluidic исследования является очевидной, почти все исследования были посвящены гермафродитки. Несмотря на мужчин приходится только 0.01-0.02% из населенности дикого типа, бесценный выводы могут возникнуть от их характеристик. Хотя физические коннектом Гермафродит нервной системы полностью сопоставлен для десятилетий17, мужской коннектом остаются неполными, особенно в регионе головы животных18. Использование кальция изображений в мужчины поможет сформировать понимание мужской нервной системы и различия, которые возникают между двумя полами. Меньший размер взрослые самцы нематоды Caenorhabditis elegans препятствует эффективной и надежной треппинга в портах погрузки традиционных обонятельных устройства, предназначенные для больших гермафродитки. Для решения этой проблемы, модифицированную версию Chronis обонятельных чип19 был разработан с более узкий порт погрузки, Нижняя высота канала и превращается в червь порту погрузки (который повернуть животное), позволяя для визуализации двусторонних влево/вправо нейрональных пар. Эта конструкция позволяет: (1 эффективное улавливание молодых взрослых мужчин, (2 более надежной ориентации животных для визуализации обоих членов двусторонних парных нейронов, и (3 точных изображений нейронной активности в мужской нейронов.
Все чаще исследования показывают, что C. elegans мужчины по-разному чем гермафродитки реагировать на целый ряд ascarosides (математический), или нематоды феромоны20,21,22,23 ,24. Таким образом развитие понимания нейронных динамики и представительств в мужской коннектом стала еще более актуальными. Мужчины C. elegans содержат 87 конкретного пола нейроны не присутствует в Гермафродит25,26, изменяя коннектом в как-пока еще неопределенного пути. Возможность изображения эти уникальные нейронных динамика позволит нам лучше понять ответы конкретного пола и нейронных представлений.
Этот протокол описывает использование мужчины адаптированных обонятельных чип нейронных образов мужчин C. elegans chemosensation. Ноцицептивных нейрон золы надежно реагирует на 1 М глицерина в мужчин, в соответствии с предыдущим гермафродиты исследований27. Воздействия на ascarosides может получить ответы, которые являются переменными от животных до животных, требующих большего количества животных, чтобы быть проверены. Ответ нейронов сем мужчины конкретных ранее было показано, через электрофизиологии и кальция изображений исследования, переменно реагировать на ascaroside #323.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мужчины адаптированных обонятельных чип включает в себя поворот в узкий порт погрузки, который позволяет для большего контроля ориентации и для эффективного улавливания мужской C. elegans. Это позволяет для визуализации левой и правой членов нейрональных двусторонних пар, без необхо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Мануэль Zimmer за предоставленную нам с файлом первоначальный дизайн был адаптирован для использования с мужчины; Франк Шредер для синтеза и поставку математический #3; Росс Lagoy за понимание и помощь с визуализации и анализа; и Лаура Aurilio для мастер изготовления и которые, наряду с Кристофер желоба, способствовали рассмотрению этой рукописи. Рамках национальных институтов здравоохранения грант 1R01DC016058-01 (ю.с.), Национальный фонд науки Грант CBET 1605679 (D.R.A.) и Берроуз Уэллком Career Award в научной интерфейс (D.R.A.) было обеспечено финансирование для этой работы.
Materials
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | – | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | – | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | – | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | – | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | – | – | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | – | – | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | – | – | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | – | – | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
Riferimenti
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
