[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية
Summary
يمكننا وصف بروتوكول للتصور للرقابة الأنسولين في الجزيرات سليمة باستخدام فلورين، بروتين فلوري أخضر حساسة لدرجة الحموضة. الجزر الصغيرة المعزولة مصابون بترميز فلورين بالإضافة إلى البضائع حويصلة neuropeptide Y إتش. وهذا يسمح للكشف عن أحداث الانصهار الحبيبية الأنسولين بالفحص المجهري [كنفوكل].
Abstract
إفراز الأنسولين يلعب دوراً مركزياً في التوازن الجلوكوز في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن المرض. النهج الحالي لدراسة الرقابة الحبيبية الأنسولين أما استخدام الكهربية أو مجهرية بالإضافة إلى التعبير عن الصحفيين الفلورسنت. ولكن معظم هذه التقنيات قد تم الأمثل لخطوط الخلايا الاستنساخ أو تتطلب الناي جزيرات البنكرياس. وفي المقابل، يسمح الطريقة المعروضة هنا للوقت الحقيقي التصور للأنسولين الحبيبية للرقابة في جزيرات البنكرياس سليمة. في هذا البروتوكول، يصف لنا أولاً العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس المعزول مع إتش ترميز حساسة لدرجة الحموضة أخضر نيون بروتين (التجارة والنقل)، فلورين، بالإضافة إلى neuropeptide Y (نبي). وثانيا، يصف لنا [كنفوكل] التصوير من الجزيرات خمسة أيام بعد العدوى الفيروسية وكيفية مراقبة إفراز الأنسولين الحبيبية. بإيجاز، توضع على ساترة في دائرة تصوير للجزر المصابة وتصويرها تحت مجهر [كنفوكل] تستقيم المسح الضوئي الليزر بينما يجري perfused باستمرار مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على المنبهات المختلفة. [كنفوكل] الصور التي تغطي 50 ميكرون من جزيرة ليلى تكتسب كالوقت الفاصل بين التسجيلات باستخدام ماسح ضوئي سريع رنانة. يمكن أن يتبع انصهار حبيبات الأنسولين مع غشاء البلازما على مر الزمن. هذا الإجراء يسمح لاختبار بطارية محفزات في تجربة واحدة أيضا ومتوافق مع الماوس والجزيرات البشرية، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ المختلفة لتصوير الوظيفية (مثلاً، غشاء الأصباغ الكالسيوم المحتملة أو سيتوسوليك).
Introduction
يتم إنتاج الأنسولين خلايا بيتا من البنكرياس جزيرة ليلى ومنظم رئيسي الجلوكوز الأيض1. الموت أو خلل وظيفي لخلايا بيتا يخل بالتوازن السكر ويؤدي إلى مرض السكري2. هي معبأة الأنسولين في الحبيبات الكثيفة الأساسية التي يتم إصدارها في Ca2 +-تعتمد طريقة3. توضيح كيف ينظم الرقابة الحبيبية الأنسولين ضروري للفهم الكامل لما يحدد إفراز الأنسولين، ويفتح آفاقاً جديدة لتحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج مرض السكري.
وتم درس الرقابة الأنسولين على نطاق واسع استخدام نهج الكهربية، مثل الغشاء السعة القياسات، والنهج المجهرية في تركيبة مع جزيئات الفلورسنت. غشاء السعة قياسات الأزمنة جيدة وتسمح تسجيلات خلية مفردة. بيد التغيرات في السعة يعكس صافي التغيير السطحي في الخلية ولا التقاط الأحداث الفردية الانصهار أو التمييز بين الانصهار الحبيبية الأنسولين من الحويصلات الافرازية غير الأنسولين الأخرى3. الطرق المجهرية، مثل انعكاس الداخلية اثنين-فوتون أو مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية في تركيبة مع تحقيقات الفلورسنت والبروتينات البضائع حويصلة، توفر تفاصيل إضافية. هذه التقنيات التقاط أحداث اكسوسيتوتيك واحد، وأيضا في مراحل ما قبل وما بعد اكسوسيتوتيك، ويمكن استخدامها لدراسة أنماط اكسوسيتوتيك في السكان من الخلايا3.
الفلورسنت الصحفيين يمكن أن تكون من ثلاثة أنواع: 1) خارج الخلية أو 2) هيولى 3) حويصلية. 1) الصحافيين خارج الخلية هي تتبع القطبية (مثلاً، ديكسترانس، سولفورهوداميني ب (SRB)، إبليس الأصفر، بيرنيني) التي يمكن تقديمها من خلال الوسط خارج الخلية4. استخدام تتبع القطبية يسمح لتحقيق المسام الانصهار في عدد أن خلايا ويلتقط الهياكل بين الخلايا المختلفة مثل الأوعية الدموية. بيد أنها لا تبلغ عن السلوك البضائع حويصلة. 2) هيولى الصحفيين هي تحقيقات الفلورسنت بالإضافة إلى البروتينات المرتبطة بالغشاء الذي يواجه السيتوبلازم، وهي تشارك في الالتحام والرقابة. وتشمل الأمثلة أعضاء نالقابلة للذوبان-اثيلماليميدي-يراعي عامل مرفق البروتين مستقبلات (الفخ) الأسرة التي استخدمت بنجاح في علم الأعصاب لدراسة العصبي الإصدار5. هذه البروتينات متعددة الشركاء ملزمة وليست الحبيبية الأنسولين المحددة. 3) حويصلية الصحفيين هي الفلورية المسابير تنصهر فيها البضائع حويصلية البروتينات التي تسمح لتحقيق سلوك حويصلة الخاصة بالبضائع. البروتينات الحبيبية الأنسولين بضائع محددة تشمل الأنسولين، ج-الببتيد وجزيرة ببتيد اميلويد ونبي بينها6،7. نبي موجودة فقط في الأنسولين الذي يحتوي على حبيبات، ويطلق يشترك مع الأنسولين، يجعلها شريكا ممتازا ل مراسل نيون8.
انصهار مختلف البروتينات الفلورية إلى نبي قد استخدمت سابقا لدراسة الجوانب المختلفة للرقابة في خلايا الغدد الصم العصبية، مثل شرط محدد سينابتوتاجمين إيسوفورمس9،10 وكيف يعتمد الوقت-الدورة التدريبية للإفراج على cytoskeleton أكتين وعلى الميوسين الثاني11،12. في هذه الدراسة، اخترنا فلورين كمراسل الفلورسنت، وهي بروتينات فلورية خضراء معدلة التي غير الفلورية على درجة الحموضة الحمضية داخل الأساسية كثيفة ولكن يصبح الزاهية الفلورسنت عند التعرض ل درجة الحموضة خارج الخلية محايدة13حبيبات. حبيبات الأنسولين ناضجة بدرجة حموضة حمضية أدناه 5.5. مرة واحدة الحبيبية الصمامات بغشاء البلازما ويفتح، يتعرض حمولتها الهيدروجيني المحايدة خارج الخلية من 7.4، السماح باستخدام فلورين البروتينات حساسة لدرجة الحموضة كمراسل7،14.
نظراً لطبيعة حساسة pH فلورين والتعبير الانتقائي لنبي في حبيبات الأنسولين، يمكن استخدامها في بناء الانصهار نبي-فلورين لدراسة الخصائص المختلفة للأنسولين الحبيبية للرقابة. إنجاز بناء الانصهار الفيروسية يضمن تعداء عالية الكفاءة ويعمل على خلايا بيتا أولية أو خطوط الخلايا وكذلك على الجزر الصغيرة المعزولة. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب كمبدأ توجيهي لدراسة الرقابة في أي نوع آخر من أنواع الخلايا مع الحويصلات المحتوية على نبي. فإنه يمكن أيضا أن يقترن مع أي نموذج الفأر وراثيا لدراسة آثار شروط معينة (كنوكدوونس، أوفيريكسبريشن، إلخ) على الرقابة. هذه التقنية قد استخدمت سابقا لوصف الأنماط المكانية والزمانية لإفراز الحبيبية الأنسولين في خلايا بيتا السكان في الجزر البشرية15.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذه المخطوطة تقنية التي يمكن استخدامها لتصور الرقابة حبيبات الأنسولين في خلايا بيتا في جزيرات البنكرياس سليمة بالفحص المجهري [كنفوكل]. فإنه يستخدم فلورين نبي كمراسل الفلورسنت المستنسخة في إتش للتأكد من كفاءة تعداء عالية.
ورغم أن الأسلوب كفاءة عالية في أيدينا، قد تتطل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مارسيا بولينا من حديد الاختزال المباشر التصوير المرافق الأساسية للحصول على مساعدة مع المجاهر. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح 1K01DK111757-01 (جا)، F31668418 (ملم)، R01 DK111538، R33 ES025673 و R56 DK084321 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
