Конфокальный изображений нейропептида Y-pHluorin: техника для визуализации экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми мышиных и человеческих островках
Summary
Мы описываем протокол для визуализации экзоцитоз инсулина в нетронутыми островами с помощью pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок. Изолированные островки заражены аденовирус кодирования pHluorin, в сочетании с везикул грузов нейропептида Y. Это позволяет для обнаружения инсулина гранул фьюжн событий confocal микроскопии.
Abstract
Секреции инсулина играет центральную роль в гомеостаз глюкозы при нормальных физиологических условиях, а также болезни. Нынешние подходы для изучения инсулина гранул экзоцитоз, либо использовать электрофизиологии или микроскопия, в сочетании с выражением флуоресцентные репортеры. Однако большинство из этих методов были оптимизированы для клоновых клеточных линий или требовать отделения панкреатических островков. В отличие от этого метод, представленные здесь позволяет для визуализации реального времени экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми панкреатических островков. В этом протоколе мы сначала описать вирусной инфекции изолированы панкреатических островков с аденовирус, который кодирует рН чувствительных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), pHluorin, в сочетании с нейропептида Y (NPY). Во-вторых мы описываем, конфокальная изображений из островков пять дней после вирусной инфекции и как контролировать гранул секреция инсулина. Кратко зараженных островков размещаются на coverslip на тепловизионные камеры и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа при будучи постоянно увлажненную с внеклеточного раствор, содержащий различные стимулы. Конфокальный изображения, охватывающих 50 мкм островок приобретаются как покадровой записи с помощью быстро резонансный сканер. Синтез инсулина гранул с плазматической мембраны может следовать со временем. Эта процедура также позволяет для тестирования аккумулятора раздражителей в одном эксперименте, совместим с мыши и человеческих островках и могут быть объединены с различные красители для функциональных изображений (например, мембранный потенциал или цитозольной кальция красители).
Introduction
Инсулин вырабатывается бета-клетки поджелудочной островок и это ключевым регулятором метаболизма глюкозы1. Смерть или дисфункции бета-клеток нарушает гомеостаз глюкозы и приводит к диабета2. Инсулин, Упакованные в плотной ядра гранул, которые выпускаются в Ca2 +–3зависимым образом. Разъяснение, как регулируется экзоцитоз гранул инсулина необходимо полностью понять, что определяет секреции инсулина и открывает новые возможности для определения новых терапевтических целей для лечения диабета.
Инсулин экзоцитоз широко изучен, с помощью электрофизиологических подходы, такие как измерения емкости мембраны и микроскопических подходов в сочетании с флуоресцентных молекул. Измерения емкости мембраны имеют хорошие временное разрешение и позволяют одну ячейку записи. Однако изменения в емкость отражают чистое изменение поверхности клетки и не захватывать события отдельных фьюжн или отличить инсулина гранул фьюжн от других инсулиннезависимым секреторные пузырьки3. Микроскопический подходы, такие как два фотона или полного внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования (TIRF) в сочетании с флуоресцентных зондов и везикул грузов белков, предоставляют дополнительные подробности. Эти методы захвата одного-exocytotic событий, а также этапов до и после exocytotic и может быть использован для изучения exocytotic моделей в популяциях клеток3.
Флуоресцентный Репортеры могут быть трех типов: 1) внеклеточная, 2) цитоплазмы или 3) пузырчатка. 1) внеклеточной журналисты являются полярные Трейсеры (например, декстраны, sulforhodamine B (SRB), Люцифер жёлтый, pyranine), которые могут быть введены через внеклеточных среды4. Использование полярного Трейсеры позволяет для расследования фьюжн поры в популяции клеток и захватывает различные межклеточных структур, таких как кровеносные сосуды. Однако они не сообщают о везикул грузов поведение. 2) цитоплазматической журналисты являются флуоресцентных зондов, в сочетании с связанный мембранами перст-белки, которые сталкиваются с цитоплазмой и участвуют в док и экзоцитоз. Примеры включают членов растворимых N– ethylmaleimide-чувствительных фактор вложений белка рецептора (SNARE) семьи, которые были успешно использованы в неврологии для изучения нейромедиатора релиз5. Такие белки имеют несколько партнеров привязки и не инсулин блок конкретных. 3) пузырчатка журналисты являются флуоресцентных зондов, сливается с везикулярного грузов белки, которые позволяют для расследования конкретных грузов везикул поведения. Белки инсулин блок конкретных грузов включают в себя инсулин и с пептида, полипептид амилоида островка, NPY среди прочих6,7. NPY присутствует только в инсулине, содержащие гранул и совместно выпустили с инсулина, что делает его отличным партнером для флуоресцентных репортер8.
Слияние различных флуоресцентных белков NPY ранее использовалась для изучения различных аспектов экзоцитоз в нейроэндокринные клетки, например требование о конкретных Синаптотагмин изоформы9,10 и как время курс релиза зависит на Цитоскелет актина и миозина II11,12. В этом исследовании, мы выбрали pHluorin как флуоресцентные репортер, который является изменение GFP, это не флуоресцентные в кислой рН внутри плотные ядра гранул но становится ярко люминесцентные под воздействием нейтральный внеклеточного pH13. Зрелые инсулина гранулы имеют кислый рН ниже 5.5. Как только Блок предохранителей с плазматической мембраны и открывается, его груз подвергается нейтральных внеклеточного pH 7,4, позволяя использовать pHluorin рН чувствительных белки как репортер7,14.
Учитывая деликатный характер pHluorin рН и селективного выражение NPY в гранулы инсулина конструкция фьюжн NPY-pHluorin может использоваться для изучить различные свойства инсулина гранул экзоцитоз. Вирусных доставки фьюжн конструкция обеспечивает высокий трансфекции эффективность и работает на основной бета-клеток и клеточных линий, а также на изолированных островков. Этот метод также может использоваться в качестве ориентира для изучения экзоцитоз в любой другой тип клеток с NPY-содержащих везикулы. Он может также сочетаться с любой трансгенные мыши модель для изучения последствий определенных условий (нокдаунов, гиперэкспрессия и т.д.) на экзоцитоз. Эта техника ранее не использовался для описания пространственных и временных моделей гранул секреции инсулина в бета клеточных популяций в человеческих островках15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описывает технику, которая может использоваться для визуализации экзоцитоз инсулина гранул в бета-клеток в пределах нетронутыми панкреатических островков confocal микроскопии. Он использует NPY-pHluorin как флуоресцентные репортер, клонированные в аденовирус обеспечить эффекти?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Марсия Boulina от DRI изображений ядра фонда за помощь с микроскопов. Эта работа была поддержана NIH грантов 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (мм), R01 DK111538, R33 ES025673 и R56 DK084321 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?. Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
