Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts
Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour la visualisation de l’exocytose de l’insuline dans les îlots intacts à l’aide de pHluorin, une protéine fluorescente verte sensibles au pH. Les îlots isolés sont infectées par l’adénovirus encodage pHluorin couplé à la vésicule fret neuropeptide Y. Cela permet la détection des événements de fusion granule insuline par microscopie confocale.
Abstract
La sécrétion de l’insuline joue un rôle central dans l’homéostasie du glucose dans des conditions physiologiques normales aussi bien que dans la maladie. Approches actuelles à étudier l’insuline granules cytotoxiques qu’utiliser électrophysiologie ou microscopie couplée à l’expression de reporters fluorescents. Cependant, la plupart de ces techniques ont été optimisée pour les lignées clonales ou besoin se dissociant des îlots pancréatiques. En revanche, la méthode présentée ici permet de visualisation en temps réel de l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots pancréatiques intacts. Dans ce protocole, nous décrivons tout d’abord l’infection virale des îlots pancréatiques isolés par l’adénovirus qui encode une pH-sensibles à la protéine fluorescente verte (GFP), pHluorin, couplée au neuropeptide Y (NPY). En second lieu, nous décrivons le confocal imagerie des îlots cinq jours après une infection virale et comment contrôler la sécrétion d’insuline granule. Brièvement, les îlots infectés sont placés sur un lamelle couvre-objet sur une chambre d’imagerie et imagés sous un microscope confocal à balayage laser vertical tout en étant continuellement perfusés avec solution extracellulaire contenant divers stimuli. Images confocales couvrant 50 µm de l’îlot sont acquis en Time-lapse enregistrements à l’aide d’un scanner rapide résonant. La fusion de granules de l’insuline avec la membrane plasmique peut être suivie au fil du temps. Cette procédure permet de tester une batterie de stimuli dans une expérience simple également, est compatible avec les souris et les îlots humains et peut être combinée avec différentes teintures pour l’imagerie fonctionnelle (p. ex., colorants de calcium cytosolique ou potentiels de membrane).
Introduction
L’insuline est produite par les cellules bêta de l’îlot pancréatique et c’est un important régulateur du métabolisme de glucose1. La mort ou la dysfonction des cellules bêta perturbe l’homéostasie du glucose et mène au diabète2. L’insuline est emballé dans les granules denses-core qui sont libérés d’un Ca2 +-dépendante manière3. Élucider comment les granules cytotoxiques de l’insuline est régulée est essentiel pour bien comprendre ce qui détermine la sécrétion d’insuline et ouvre de nouvelles voies pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du diabète.
Exocytose d’insuline a été étudiée en utilisant des approches électrophysiologiques, telles que les mesures de capacité membranaire et approches microscopiques en combinaison avec des molécules fluorescentes. Les mesures de capacité membrane ont bonne résolution temporelle et permettent des enregistrements de cellule unique. Cependant, des changements dans la capacité reflètent la variation nette de surface de la cellule et ne pas capturer les événements de fusion individuels ou distinguer fusion de granules de l’insuline d’autres vésicules de sécrétion non insulino-3. Les approches microscopiques, telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion interne totale ou deux photons en combinaison avec des sondes fluorescentes et protéines de vésicule de cargo, fournissent des détails supplémentaires. Ces techniques de capture des événements exocytotique uniques et aussi les phases préalables- et post-exocytotique et peuvent être utilisés pour l’étude des tendances exocytotique dans les populations de cellules3.
Fluorescents reporters peuvent être de trois types : 1) extracellulaire, 2) cytoplasmique ou 3) vésiculaire. 1) extracellulaires reporters sont des traceurs polaires (par exemple, dextrans, la sulforhodamine B (SRB), lucifer jaune, pyranine) qui peuvent être introduits dans le milieu extracellulaire4. L’utilisation de traceurs polaires permet d’enquête sur le pore de fusion dans une population de cellules et capture des différentes structures intercellulaires tels que les vaisseaux sanguins. Toutefois, ils ne signalent pas sur le comportement de cargaison de vésicule. 2) cytoplasmiques reporters sont des sondes fluorescentes, couplés à des protéines associées aux membranes qui face le cytoplasme et sont impliqués dans la station d’accueil et d’exocytose. Les exemples incluent des membres de la famille de récepteurs (SNARE) en protéines soluble Nfacteur sensible – éthylmaléimide attachement qui ont été utilisées avec succès en neurosciences pour l’étude des neurotransmetteurs release5. Ces protéines ont des partenaires multiples et ne sont pas l’insuline-granule spécifique. 3) vésiculaires reporters sont des sondes fluorescentes fusionnés aux protéines cargo vésiculaire qui permettent pour l’étude du comportement de la vésicule de marchandises spécifiques. Protéines spécifiques fret insuline-granule comprennent, entre autres, l’insuline, peptide c, polypeptide amyloïde d’îlot et NPY6,7. NPY n’est présent que dans l’insuline contenant des granules et est publié conjointement avec l’insuline, ce qui en fait un excellent partenaire pour un journaliste fluorescent8.
La fusion de différentes protéines fluorescentes NPY a été précédemment employée pour étudier divers aspects de l’exocytose dans les cellules neuroendocrines, telles que l’exigence de la synaptotagmine spécifique isoformes9,10 et comment le temps de sortie dépend sur le cytosquelette d’actine et la myosine II11,12. Dans cette étude, nous avons choisi pHluorin comme le journaliste fluorescent, qui est une mis à jour le GFP qui est non fluorescent au pH acide à l’intérieur du noyau dense granules mais devient brillamment fluorescent lors de l’exposition au neutre pH extracellulaire13. Granulés à insuline matures ont un pH acide inférieures à 5,5. Une fois que le granule fusionne avec la membrane plasmique et ouvre, sa cargaison est exposée au neutre pH extracellulaire de 7.4, permettant l’utilisation de la pHluorin de protéines sensibles au pH comme reporter7,14.
Compte tenu du caractère sensible de pH de pHluorin et l’expression sélective de NPY dans les granules de l’insuline, la construction de fusion NPY-pHluorin peut être utilisée pour étudier les différentes propriétés des granules cytotoxiques de l’insuline. La livraison virale de la construction de fusion assure un rendement élevé de transfection et travaille sur des cellules primaires de bêta ou de lignées cellulaires ainsi que sur les îlots isolés. Cette méthode peut également être utilisée comme ligne directrice pour étudier l’exocytose dans tout autre type de cellule avec vésicules contenant NPY. Il peut aussi être combiné avec n’importe quel modèle de souris transgénique pour étudier les effets de certaines conditions (passes rabattues, la surexpression, etc.) sur l’exocytose. Cette technique a été précédemment utilisée pour caractériser les tendances spatiales et temporelles de l’insulinosécrétion granule dans les populations de cellules bêta dans les îlots humains15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une technique qui permet de visualiser l’exocytose des granules de l’insuline dans les cellules bêta dans les îlots pancréatiques intacts par microscopie confocale. Il utilise NPY-pHluorin comme le journaliste fluorescent cloné dans adénovirus pour assurer une efficacité de transfection élevé.
Bien que la méthode était très efficace dans nos mains, il pourrait avoir besoin de quelques modifications qui dépendent principalement de deux paramètres : 1) la qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Marcia Boulina de la DRI laboratoire central de l’aide avec les microscopes d’imagerie. Ce travail a été soutenu par les NIH subventions 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, ES025673 R33 et R56 DK084321 (AC).
Materials
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22×40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
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