استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة
Summary
بروتوكول أوسام الموصوفة هنا الأمثل لاستزراع astrocytes مورين بمعزل عن غيرها من خلايا المخ بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة. أستروسيتيس أوسام معرض عفوية Ca2 + إشارات ومورفولوجيا والجينات التعبير ملامح مشابهة ل astrocytes في فيفو.
Abstract
أوسام ( لوث-تكلف هعاصي sطلعت ستروسيتي مسلوب) ينطوي البروتوكول بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة لتوليد كميات كبيرة من فيفو–مثل الماوس وفار astrocyte الزراعات الأحادية : يمكن عزل خلايا الدماغ من مناطق مختلفة من الدماغ، وبعد أسبوع ثقافة الخلية، تخلصت الخلايا غير أستروسيتيك بوضع أطباق الثقافة على شاكر ح 6 في الحاضنة. ثم يتم باساجيد astrocytes المتبقية في لوحات جديدة مع وسيلة محددة astrocyte (يطلق عليها NB + H). ملحوظة: + ح تحتوي على تركيزات منخفضة من الهيبارين-ملزمة مماثلة مثل عامل النمو (هبيجف)، الذي يستخدم بدلاً من المصل في المتوسط. بعد تزايد في NB + H، قد أستروسيتيس أوسام مورفولوجيا النجمية وميزة العمليات الدقيقة. وعلاوة على ذلك، أن هذه أستروسيتيس أكثر في فيفو–مثل التعبير الجيني من astrocytes المتولدة عن أساليب نشرها مسبقاً. Ca2 + تصوير وديناميات حويصلة، وأحداث أخرى قريبة من الغشاء وبالتالي يمكن دراستها في العمليات أستروسيتيك الجميلة في المختبر، مثلاً، باستخدام الخلايا الحية [كنفوكل] أو مجهرية TIRF. جدير بالذكر أن أستروسيتيس أوسام أيضا يحمل عفوية Ca2 + إشارات مماثلة إلى astrocytes في فيفو.
Introduction
أستروسيتيس تؤثر على وظيفة المخ من خلال الدعم الغذائي وتدفق الدم، وإشارات متشابك واللدونه والاتصالات بين الخلايا–وهي الآليات التي تتمحور حول عمليات أستروسيتيك رقيقة. يسمح البروتوكول أوسام الموصوفة هنا دراسة هذه العمليات دون تدخل من الخلايا العصبية وغيرها إطلاق، ومفيدة مثلاً، للتعبير عن العديد من البروتينات وحتى Ca2 + إشارات التداخل عبر خلايا الدماغ المختلفة أنواع. علاوة على ذلك، هذا الأسلوب يتغلب على القيود المفروضة على التقنيات المتاحة سابقا. على وجه الخصوص، يوفر لنا البروتوكول في فيفو–مثل طريقة رخيصة والتعبير الجيني في سريعة، سهلة، ومورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة).
مورفولوجيا الخلايا والجينات، والعديد من العمليات التنظيمية الأخرى تتأثر مباشرة بالبيئة. في صحن ثقافة، يشير هذا إلى عوامل الصادرة عن الخلايا المحيطة بها، ولكن أيضا الوسيلة التي تزرع الخلايا. أستروسيتيس، هبيجف أفيد سابقا للحث على مورفولوجيا النجمية1 لكن وجد أيضا إزالة التمييز بين أستروسيتيس2. ومع ذلك، استخدمت تركيزات أقل من هبيجف في وقت لاحق لتوليد المزيد في فيفو–مثل أستروسيتيس كما حددت عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي في اثنين من البروتوكولات المختلفة3،4. وعلاوة على ذلك، تتغير مورفولوجيا astrocyte مع تكوين المتوسطة، بغض النظر عن البروتوكول4: المتوسطة نيوروباسال بتركيز منخفض من هبيجف الأمثل لزراعة النجمية astrocytes، بينما الأخرى التراكيب متوسطة الحجم (مثلاً، مصل الدم المحتوية على دميم) إنتاج خلايا مضلعة (حتى في أستروسيتيس طازجة تم عزلة بواسطة إيمونوبانينج).
بروتوكول أوسام ويتغلب على عيوب الأساليب السابقة لزراعة الزراعات الأحادية أستروسيتي4. التقنيات السابقة لزراعة الزراعات الأحادية astrocyte قد العيوب التالية: مورفولوجيا المضلع، وغير معهود من النجمية astrocytes في فيفو (الأسلوب MD)5؛ طول وتكلفة من البروتوكول (إعداد أستروسيتيس من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent يأخذ ثلاثة أشهر ويتطلب العديد من الكواشف، بما في ذلك تكلفة عوامل النمو)6؛ كميات قليلة من المواد (طريقة إيمونوبانينج)3؛ والتفريق بين دي astrocytes واشتراط مصفوفة ثلاثية الأبعاد (بوشمان et al.) 1 , 2. وفي المقابل، يوفر البروتوكول أوسام: في فيفو–مثل مورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة)؛ سريعة وسهلة، وطريقة رخيصة؛ كميات كبيرة من المواد؛ والأكثر في فيفو–مثل التعبير الجيني بالمقارنة مع إيمونوبانيد والعضو المنتدب أستروسيتيس. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الثقافة 2D لدراسة Ca2 + الإشارات وإعادة التدوير في عمليات رقيقة، وفي أحداث قريبة من الغشاء حويصلة (مثلاً، TIRF المجهري ليست ممكنة في الثقافات 3D).
وقد استخدمت الأسلوب MD على نطاق واسع منذ صدوره في عام 19805، تقدم تقنية بسيطة وسريعة للزراعات الأحادية astrocyte المضلع. وباختصار، ينطوي الأسلوب MD تنامي خلايا المخ المختلطة في مصل العجل الجنين (FCS)-تحتوي على دميم، تليها تهز الخطوات التي يغني عن astrocytes (كسائر أنواع فصل من الطبق خلايا الدماغ) وكذلك الثقافة في المتوسط نفسها. ويستخدم دميم وتستكمل مع السفح للعديد من أنواع الخلايا الأخرى، بدءاً من الخلايا الليفية و adipocytes خطوط الخلايا السرطان المختلفة، كل منها حصة مورفولوجية المضلع أظهرتها astrocytes العضو المنتدب في الثقافة. حتى أوائل القرن الحادي والعشرين7، يكن الفكر قليلاً نظراً لوسائل الإعلام لتلائم astrocytes، على وجه التحديد لصالح على مورفولوجيا النجمية نموذجي وجدت فيفو في. بروتوكول واحد ونشرت في عام 2011 تحقيق مثل هذا التشكل النجمية: استدعاء الأسلوب إيمونوبانينج، أنها توظف المتوسطة خالية من المصل الأمثل لاستزراع astrocytes3. باستخدام هذا الأسلوب، تتعرض خلايا المخ طازجة معزولة لسلسلة من الأطباق المغلفة بالأجسام المضادة التي تستهدف الخلية الخلية المحددة بنوع البروتينات السطحية، إثراء ل astrocytes. على الرغم من أكثر في فيفو–مثل مورفولوجيا والتعبير الشخصية من أستروسيتيس إيمونوبانيد، لا تزال تعتمد على الأسلوب astrocyte MD معظم الدراسات في المختبر . الأسلوب MD بسيط وسريع، بينما الأسلوب إيمونوبانينج تضم أكثر من خطوات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً اليوم الأول للثقافة (مثل فترات أطول إنزيم الهضم، طبقات حذراً من حلول كثافة مختلفة، إيمونوبانينج نفسها، و عدة الطرد المركزي الخطوات-كل شيء قبل الطلاء). ومع ذلك، باستخدام المتوسط أكثر تخصصا، يقدم الأسلوب أوسام كلا سرعة الأسلوب MD و في فيفو–مثل مورفولوجيا بروتوكول إيمونوبانينج.
عموما، بروتوكول أوسام مفيدة لدراسة أكثر في فيفو–مثل أستروسيتيس في 2D الزراعات الأحادية المعزولة من الخلايا العصبية وإطلاق أخرى (ك تتسم سابقا4 إيمونوستينينجس، إيمونوبلوتس، وتسلسل الحمض النووي الريبي). أنها تسمح لدراسة العمليات أستروسيتيك رقيقة، ويوفر إمكانية كبيرة لتصور Ca2 + إشارات عفوية وأحداث قريبة من الغشاء (مثلاً، تصويرها بالمجهر TIRF).
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأربع في إطار البروتوكول حرجة: 1) إعداد تركيز هبيجف على وجه التحديد 5 نانوغرام/ملليلتر، حيث يمكن أن تؤدي الزيادات الصغيرة في التركيز للثقافات غير ناضجة، مثلاً، 10 نانوغرام/مل هبيجف سوف يفرق دي astrocytes4؛ 2) تجنب الفقاعات في الحلول التي تحتوي على الأنسجة أو الخلايا الت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (FP7/260916) وألكسندر فون همبولت-ستيفتونغ (سوفجا كوفاليفسكاجا) والألمانية الأوقيانوغرافية (DE1951 و SFB889).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
Riferimenti
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
