Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato
Summary
O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.
Abstract
O AWESAM (um low-custo easy stellate umstrocyte method) protocolo implica uma maneira rápida, simples e barata para gerar grandes quantidades de in vivo-como monoculturas de rato e rato astrocyte : As células do cérebro podem ser isoladas de regiões diferentes do cérebro, e após uma semana de cultura de células, as células não-hamartomas são sacudidas, colocando os pratos de cultura num agitador para 6 h na incubadora. Os astrócitos restantes são então passados para novas placas com meio astrocyte específicos (denominado NB + H). NB + H contém baixas concentrações de heparina-ligação EGF fator de crescimento semelhante (HBEGF), que é usado no lugar de soro no meio. Após ter crescido em NB + H, astrócitos AWESAM têm uma morfologia estrelada e processos bem característica. Além disso, estes astrócitos têm mais na vivo-como expressão do gene que astrócitos gerados pelos métodos anteriormente publicados. Imagem latente de CA2 + , dinâmica de vesículas e outros eventos perto da membrana, portanto, podem ser estudados no bem processos hamartomas em vitro, por exemplo, usando a célula viva confocal ou microscopia TIRF. Notavelmente, astrócitos AWESAM também apresentam espontânea Ca2 + sinalização semelhante de astrócitos na vivo.
Introduction
Astrócitos influenciam a função cerebral através de suporte trófica, fluxo sanguíneo, sinalização sináptica e plasticidade e comunicação intercelular – todos os quais são mecanismos que giram em torno dos processos hamartomas finos. O protocolo AWESAM descrito aqui permite que o estudo desses processos sem interferência de neurônios e outro glia, que é útil , por exemplo, porque a expressão de muitas proteínas e até mesmo de Ca2 + sinalização se sobrepõem em toda célula cerebral diferente tipos. Além disso, este método supera as limitações das técnicas anteriormente disponíveis. Em particular, o nosso protocolo fornece na vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos) e expressão gênica em um rápido, fácil e barata maneira.
Morfologia celular, expressão gênica e muitos outros processos regulatórios são diretamente influenciados pelo ambiente. Em um prato de cultura, refere-se a fatores liberados por células circundantes, mas também o meio no qual as células são cultivadas. Para astrócitos, HBEGF foi relatado anteriormente para induzir uma morfologia estrelado1 mas verificou-se, também, para diferenciar de astrócitos2. No entanto, concentrações de HBEGF foram usadas mais tarde para a geração mais na vivo-astrócitos como identificados por meio de sequenciamento de RNA em dois diferentes protocolos de3,4. Além disso, a morfologia astrocyte altera com a composição média, independentemente do protocolo4: Neurobasal médio com uma baixa concentração de HBEGF é ideal para o cultivo de astrócitos estrelados, enquanto outras composições médios (por exemplo, contendo soro DMEM) produzir células poligonais (mesmo em astrócitos recentemente isolados por immunopanning).
O protocolo AWESAM supera as desvantagens das técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte4. Técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte têm as seguintes desvantagens: morfologia poligonal, que é característico de astrócitos estrelado na vivo (método de MD)5; o comprimento e o custo do protocolo (astrócitos tomadas de células-tronco pluripotentes induzidas a preparar três meses e requer muitos reagentes, incluindo fatores de crescimento caros)6; as pequenas quantidades de material (método immunopanning)3; e a diferenciação dos astrócitos e exigência de uma matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. em contraste, o protocolo AWESAM fornece: no vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos); um rápido, fácil e barato método; grandes quantidades de material; e a maioria na vivo-como expressão de gene em comparação com immunopanned e astrócitos MD. Além disso, permite a cultura 2D para o estudo da sinalização de Ca2 + e vesículas de reciclagem em finos processos e em eventos perto da membrana (por exemplo, microscopia TIRF não é possível em culturas 3D).
O método de MD tem sido usado extensivamente desde sua publicação em 19805, oferecendo uma técnica simples e rápida para monoculturas astrocyte poligonal. Em breve, o método de MD implica crescente neurónios misto no soro fetal bezerro (FCS)-contendo DMEM, seguido por etapas que enriquecem para astrócitos (como todas as outras células cerebrais tipos desanexar do prato) e mais cultura no mesmo meio a tremer. DMEM suplementado com FCS é usado para muitos outros tipos de células, variando de fibroblastos e adipócitos para linhas de células de câncer diferentes, os quais compartilham a morfologia poligonal exibida por astrócitos MD na cultura. Até o início dos anos 20007, pouco tinha sido dada a mídia sob medida para astrócitos, especificamente favorecer sua morfologia típica estrelada encontrado em vivo. Um protocolo publicado em 2011 alcançar tal morfologia estrelada: chamado o método immunopanning, emprega meio livre de soro otimizado para cultivo de astrócitos3. Usando este método, as células do cérebro recentemente isolada estão expostas a uma série de pratos revestidos com anticorpos que se destinam a proteínas de células específicas do tipo de célula superfície, enriquecer para astrócitos. Apesar do mais na vivo-como perfil morfologia e expressão de astrócitos immunopanned, a maioria dos estudos em vitro ainda depende do método de astrocyte MD. O método de MD é simples e rápido, enquanto o método de immunopanning é composto por etapas mais complexas e demoradas no primeiro dia da cultura (tais como longos períodos de digestão enzimática, estratificação cuidadosa das soluções de diferente densidade, immunopanning em si, e vários centrifugação passos – tudo isso antes de chapeamento). No entanto, usando o meio mais especializado, o método AWESAM oferece tanto a velocidade do método MD e o na vivo-como a morfologia do protocolo immunopanning.
Em geral, o protocolo AWESAM é útil para estudar mais na vivo-gosto de astrócitos em 2D monoculturas isolados dos neurônios e outro glia (como anteriormente caracterizadas4 por immunostainings immunoblots e sequenciamento de RNA). Ele permite o estudo de processos hamartomas finos e fornece grande acessibilidade para a visualização de Ca2 + sinalização espontânea e eventos perto da membrana (por exemplo, fotografada por microscopia TIRF).
Protocol
Representative Results
Discussion
Quatro etapas dentro do protocolo são fundamentais: 1) preparando a concentração HBEGF precisamente 5 ng/ml, uma vez que pequenos aumentos na concentração podem levar a culturas imaturas, por exemplo, 10 ng/mL HBEGF diferenciará de astrócitos4; 2) evita bolhas nas soluções que contêm tecidos ou células, que podem alterar o pH e impedir a saúde astrocyte; 3) pre-desenroscada mídia para atingir o pH ideal e a temperatura para o crescimento saudáveis astrócitos; 4) troca de ap…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos que o financiamento do Conselho Europeu de investigação (7. º PQ/260916), a Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
Riferimenti
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