في فيفو كشف وتحليل م ع سومويليشن البروتين في الخلايا البشرية
Summary
يتم مترافق البروتينات الأسرة الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) للمخلفات يسين من البروتينات المستهدفة لتنظيم مختلف العمليات الخلوية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول للكشف عن البروتين الشبكية (الميزانية العادية) سومويلاتيون في ظل الظروف الداخلية والخارجية في الخلايا البشرية.
Abstract
تعديلات بوستترانسلاشونال للبروتينات حاسمة بالنسبة للتنظيم السليم لتوصيل الإشارة داخل الخلايا. بين هذه التعديلات، الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط ببقايا يسين من مجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة لتنظيم العمليات الخلوية، مثل النسخ الجيني وإصلاح الحمض النووي والبروتين التفاعل والتدهور والنقل سوبسيلولار وتوصيل الإشارة. ويستند النهج الأكثر شيوعاً للكشف عن البروتين سومويليشن التعبير وتنقية البروتينات المعلمة المؤتلف في البكتيريا، مما يسمح في المختبر بيوكيميائية فعل وبسيطة وملائمة لمعالجة ميكانيكية الأسئلة. ومع ذلك، نظراً لتعقد عملية سومويلاتيون في فيفو، أنها أكثر تحديا لكشف وتحليل البروتين سومويلاتيون في الخلايا، وخاصة عندما تكون تحت الظروف الذاتية. كشف دراسة حديثة أجراها أصحاب هذه الورقة أن الشبكية الذاتية (الميزانية العادية) البروتين، القامع ورم أمر حيوي لتنظيم السلبية لتطور دورة الخلية، سومويلاتيد على وجه التحديد في المرحلة G1 المبكر. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل “الميزانية العادية سومويليشن” في ظل الظروف الداخلية والخارجية على حد سواء في الخلايا البشرية. هذا البروتوكول مناسبة للتحقيق الشكلية والوظيفية في السومو-تعديل الميزانية العادية، فضلا عن العديد من استهداف سومو البروتينات الأخرى، في الخلايا البشرية.
Introduction
مراقبة دقيقة لتطور دورة الخلية في الخلايا حقيقية النواة يستند إلى شبكة تنظيمية ضيقة، مما يضمن أن أحداث معينة تجري طريقة مرتبة1،2. واحد من اللاعبين الرئيسيين في هذه الشبكة هو البروتين الشبكية (الميزانية العادية)،1،القامع الورم المستنسخة الأولى3. البروتين Rb يعتقد أن منظم سلبية لتطور دورة الخلية، لا سيما بالنسبة G0/G1 S المرحلة الانتقالية، والورم النمو4،5. فشل الدالة Rb أما مباشرة يؤدي إلى خبيثة اللاصقة الأكثر شيوعاً في الأطفال، والشبكية، أو يساهم في تطوير العديد من أنواع أخرى من السرطان5. وعلاوة على ذلك، تشارك في العديد من المسارات الخلوية بما في ذلك الخلية التمايز، الكروماتين يعيد البناء، والمبرمج بوساطة الميتوكوندريا3،،من67الميزانية العادية.
تعديلات بوستترانسلاشونال تلعب دوراً محوريا في تنظيم الميزانية العادية وظيفة8،9. الفسفرة واحد مثل هذا التعديل، وأنه يؤدي عادة إلى المنظمة الممولة من الميزانية العادية. في هادئة G0 الخلايا، الممولة من الميزانية العادية بنشاط مع مستوى منخفض الفسفرة. كما خلايا التقدم من خلال مرحلة G0/G1، الميزانية العادية التتابع فرط–فوسفوريلاتيد سلسلة من مؤنزم cyclin تعتمد على البروتين (كدكس) وسيكلينس، مثل cyclin E/CDK2 و cyclin د/CDK4/6، الذي يعطل Rb والقضاء على قدرتها على قمع دورة الخلية المتعلقة بالجينات التعبير4،10. يمكن أيضا تعديل الميزانية العادية بمعدل المتصلة ubiquitin الصغيرة (سومو)11،،من1213.
سومو هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة. من الأهمية بمكان للعمليات الخلوية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية، والنسخ، والبروتين الخلوي التعريب وتدهور، والنقل والحمض النووي الإصلاح14،،من1516، 17 , 18-مسار التصريف “سومو” يتكون من الإنزيم تفعيل E1 سومو ديميريك SAE1/UBA2، واحد E2 التصريف الإنزيم Ubc9 ومتعددة E3 ligases والبروتياز سومو على حدة. عموما، يجب معالجة الوليدة سومو البروتينات بروتيوليتيكالي لتوليد شكل ناضج. تنشيط بواسطة هيتيروديمير E1 سومو ناضجة وثم نقل إلى E2 الإنزيم Ubc9. أخيرا، هو تساهمي مترافق جليكاين ج–المحطة الطرفية من السومو إلى يسين المستهدفة من الركازة، ومما ييسر هذه العملية عادة ب E3 ligases. يمكن إزالة البروتين السومو من الركازة معدلة من البروتياز محددة. وقد كشفت دراسة سابقة بواضعي هذه الورقة أن “سومويلاتيون م ع” الزيادات الملزمة بأن CDK2، مما يؤدي إلى فرط الفسفرة في المرحلة G1 المبكر، هي عملية ضرورية ل تقدم دورة الخلية13. كما أثبتنا أن فقدان “سومويليشن م ع” أسباب تكاثر خلية انخفض. وعلاوة على ذلك، أنه اتضح مؤخرا أن يحمي سومويليشن Rb البروتين Rb من proteasomal دوران، مما يزيد من مستوى الميزانية العادية البروتين في خلايا19. ولذلك، سومويليشن دوراً هاما في وظيفة الميزانية العادية في مختلف العمليات الخلوية. لمزيد من الدراسة نتيجة الوظيفية والفسيولوجية أهمية “سومويليشن الميزانية العادية”، من المهم تطوير وسيلة فعالة لتحليل حالة السومو من الميزانية العادية في الخلايا البشرية أو أنسجة المريض.
سومويليشن عملية ديناميكية للغاية، وعكسها. وبالتالي، من الصعب عادة لكشف البروتينات سومو تعديل الظروف الذاتية تماما. وتعرض هذه الورقة طريقة لاكتشاف الذاتية “م ع سومويليشن”. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيفية الكشف عن خارجية “سومويلاتيون م ع” م ع البرية من نوع و الطفرات السومو التي تفتقر إلى11. على وجه الخصوص، وصف جاكوبس et al. أسلوب لزيادة تعديل سومو الركازة معين على وجه التحديد بتوجه الانصهار Ubc9 سومويلاتيون (UFDS)20. استناداً إلى هذا الأسلوب، يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل سومويلاتيون القسري “من الميزانية العادية” وآثارها الفنية. نظراً لأن مئات ركائز سومو قد وصفت سابقا وتم تحديد أكثر من ركائز سومو المفترضة من العديد من الاختبارات المستندة إلى البروتين، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على تحليل السومو-تعديل هذه البروتينات في الخلايا البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل سومويلاتيون الذاتية “للميزانية العادية” في الخلايا البشرية. كما أن هذا الأسلوب هو تركز تحديداً على البروتين Rb الذاتية دون أي تناوب الإشارات العالمية المتصلة سومو، أنها أداة مهمة للتحقيق في تعديل الميزانية العادية-سومو الظروف الفسيولوجية طبيعية ت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة المنح من العلم والتكنولوجيا لجنة شانغهاي (المنحة رقم 14411961800) ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (المنحة رقم 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
Riferimenti
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
