In Vivo Détection et analyse des Rb SUMOylation de protéines dans les cellules humaines
Summary
Protéines de la famille petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) sont conjugués aux résidus lysine de protéines cibles pour réglementer divers processus cellulaires. Cet article décrit un protocole pour la détection de la protéine du rétinoblastome (Rb) SUMOylation conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines.
Abstract
Les modifications post-traductionnelles des protéines sont cruciales pour la règlementation propre de transduction de signaux intracellulaires. Parmi ces modifications, petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente aux résidus lysine d’une variété de protéines cibles pour réguler les processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la réparation de l’ADN, protéine interaction et la dégradation, transport intracellulaire et transduction du signal. L’approche la plus courante à la détection des protéines SUMOylation est basé sur l’expression et purification de protéines recombinantes marqués chez les bactéries, ce qui permet une réaction in vitro biochimique qui est simple et adapté pour l’adressage mécaniste questions. Toutefois, en raison de la complexité du processus de SUMOylation in vivo, il est plus difficile à détecter et analyser les protéines SUMOylation dans les cellules, surtout lorsque des conditions endogènes. Une étude récente menée par les auteurs de cette étude a révélé que la protéine du rétinoblastome endogène (Rb), un suppresseur de tumeur qui est essentiel à la régulation négative de la progression du cycle cellulaire, est spécifiquement SUMOylated au début de la phase G1. Cet article décrit un protocole pour la détection et l’analyse de SUMOylation Rb conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Ce protocole est approprié pour l’étude phénotypique et fonctionnelle du SUMO-modification du Rb, ainsi que plusieurs autres protéines SUMO ciblées, dans les cellules humaines.
Introduction
Le contrôle précis de la progression du cycle cellulaire dans les cellules eucaryotes repose sur un réseau serré de réglementation, qui s’assure que des événements particuliers se déroulent dans une manière ordonnée1,2. Un des principaux acteurs de ce réseau est la protéine du rétinoblastome (Rb), la première tumeur clonés suppresseur1,3. La protéine Rb est considérée comme un régulateur négatif de la progression du cycle cellulaire, en particulier pour le G0/G1 à transition de phase S et la croissance de tumeur4,5. Défaillance de la fonction de Rb soit conduit directement à la malignité intraoculaire plus courante chez les enfants, rétinoblastome, ou contribue au développement de nombreux autres types de cancer,5. En outre, Rb est impliqué dans plusieurs voies cellulaires dont la différenciation cellulaire, remodelage de la chromatine et l’apoptose médiée par les mitochondries3,6,7.
Modifications post-traductionnelles jouent un rôle essentiel dans la régulation de RB fonction8,9. La phosphorylation est une telle modification, et il conduit généralement à l’inactivation de Rb. Dans les cellules quiescentes G0, Rb est actif avec un niveau faible de phosphorylation. Comme les cellules franchiront phase G0/G1, Rb est séquentiellement hyper-phosphorylés par une série de kinases cycline-dépendante de protéine (CDKs) et cyclines, tels que de la cycline E/CDK2 et cycline D/CDK4/6, qui inactivent Rb et éliminer sa capacité à réprimer le cycle cellulaire associés de gene expression4,10. RB peut également être modifié par petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO)11,12,13.
SUMO est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente à une variété de protéines cibles. Il est crucial pour divers processus cellulaires, y compris la régulation du cycle cellulaire, la transcription, la localisation cellulaire des protéines et dégradation, transport et ADN réparation14,15,16, 17 , 18. voie de conjugaison le SUMO se compose de l’enzyme activatrice E1 SUMO dimère SAE1/UBA2, la seule enzyme de conjugaison E2 Ubc9, multiples E3 ligases et protéases spécifiques SUMO. En règle générale, les protéines SUMO naissantes doivent être traitées de clivage protéolytique pour générer la forme mature. Le SUMO mature est activé par l’hétérodimère E1 et ensuite transféré à l’enzyme E2 Ubc9. Enfin, la glycine C-terminale du SUMO est par covalence conjugué à la lysine de la cible d’un substrat, et ce processus est généralement facilité par l’E3 ligases. La protéine SUMO peut être supprimée de la mis à jour le substrat par des protéases spécifiques. Une étude antérieure par les auteurs de cette étude a révélé que la SUMOylation de Rb augmente sa liaison à CDK2, conduisant à la phosphorylation hyper à la phase précoce de la G1, un processus qui est nécessaire pour la progression de cycle cellulaire13. Nous avons aussi démontré que la perte de SUMOylation Rb provoque une prolifération cellulaire réduite. En outre, il a été démontré récemment que la SUMOylation de Rb protège la protéine Rb de proteasome chiffre d’affaires, ce qui augmente le taux de protéine Rb en cellules19. Par conséquent, la SUMOylation joue un rôle important en fonction de la Rb dans divers processus cellulaires. Afin d’étudier les conséquences fonctionnelles et pertinence physiologique de SUMOylation Rb, il est important de développer une méthode efficace pour analyser l’État SUMO de Rb dans les cellules humaines ou les tissus du patient.
SUMOylation est un processus réversible, très dynamique. Ainsi, il est généralement difficile de détecter les protéines SUMO-modifiées dans des conditions totalement endogènes. Cet article présente une méthode pour détecter la SUMOylation endogène de Rb. En outre, il montre comment détecter exogène Rb SUMOylation de Rb sauvage et sa mutation de SUMO-deficient11. En particulier, Jacobs et coll. décrit une méthode pour augmenter la modification de SUMO d’un substrat donné spécifiquement par Ubc9 fusion dirigée SUMOylation (UFD)20. Selon cette méthode, ce protocole décrit comment analyser la SUMOylation forcé de Rb et ses conséquences fonctionnelles. Étant donné que des centaines de substrats SUMO ont été décrits précédemment et plusieurs substrats SUMO présumés ont été identifiés de nombreuses analyses protéomiques, ce protocole peut être appliqué pour analyser la SUMO-la modification de ces protéines dans les cellules humaines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole visant à détecter et analyser la SUMOylation endogène de Rb dans les cellules humaines. Comme cette méthode est spécifiquement axée sur la protéine Rb endogène sans aucune modification du signal global de SUMO, c’est un outil important pour enquêter sur les modification de Rb-SUMO dans des circonstances tout à fait naturelles physiologiques.
Pour atteindre cet objectif, il est important de garder à l’esprit que : 1) bien que SUMO comprend quatre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de la Science et la technologie Commission de Shanghai (concession no 14411961800) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81300805).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
Riferimenti
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
