Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

Summary

Le canal excréteur de c. elegans est un modèle unique de cellules individuelles pour l’analyse visuelle in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé. Ce protocole décrit une combinaison de génétique/Arni standard et approches, adaptables pour l’identification et la caractérisation des molécules diriger tubulogenèse unicellulaires et apicale biogenèse membranaire et lumen d’imagerie.

Abstract

Les quatre canaux excréteurs de c. elegans sont des tubes étroits étendus sur toute la longueur de l’animal d’une seule cellule, avec presque aussi beaucoup étendu endotubes intracellulaires qui génèrent et stabiliser la lumière avec une membrane et submembraneous cytosquelette des caractères apicale. La cellule excrétrice élargit sa longueur environ 2 000 fois pour générer ces canaux, rendant ce modèle unique pour l’évaluation in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé, morphogenèse lumen intracellulaire et unicellulaires tubulogenèse. Le protocole présenté ici montre comment combiner la norme d’étiquetage, gain et perte de-fonction génétique ou l’interférence ARN (ARNi)-et des approches microscopiques d’utiliser ce modèle pour disséquer visuellement et fonctionnellement analyser ces processus au niveau moléculaire. Comme exemple d’une démarche d’étiquetage, le protocole décrit la production d’animaux transgéniques avec des protéines de fusion fluorescent pour analyse en direct tubulogenèse. Comme un exemple d’une approche génétique, il met en évidence les points clés d’un visuel d’Arni interaction écran visant à modifier un phénotype de gain de fonction canal cystique. Les méthodes spécifiques décrites sont Comment : étiqueter et visualiser les canaux en exprimant des protéines fluorescentes ; construire une bibliothèque de RNAi ciblée et élaborer des stratégies RNAi de dépistage pour l’analyse moléculaire de la morphogenèse du canal ; évaluer visuellement les modifications des phénotypes de canal ; marquer en disséquant la microscopie de fluorescence ; caractériser les composants subcellulaires canal à résolution plus élevée par microscopie confocale ; et de quantifier les paramètres visuels. L’approche est utile pour le chercheur qui s’intéresse en profitant du canal excréteur c. elegans pour identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus phylogénétiquement conservées de lumen intracellulaire et unicellulaires tube de morphogenèse.

Introduction

Tous les organes internes sont composés de tubes, cruciales pour leurs nombreuses fonctions différentes, tels que le transport et l’échange de gaz, les liquides et les nutriments et l’excrétion des déchets métaboliques. Leur caractère polarisé, avec les membranes apicales et lumière distinctes, est adaptée à ces fonctions spécifiques, et les défauts dans la biogenèse des systèmes endo – et la membrane plasmique sont une cause fréquente de maladie humaine^1,2. La plupart des tubes du système vasculaire et des organes internes est pluricellulaire et forme une lumière entre les cellules ; Cependant, tubes unicellulaires qui forment la lumière dans les cellules, peuvent, par exemple, représenter autant que 30 à 50 % des humains lits capillaires². Les membranes polarisées de multi – tubes et unicellulaires sont semblables dans la composition, bien que leur microdomaines peuvent différer basé sur la fonction spécifique du tube (p. ex., les canalicules de canal excréteur versus microvillosités intestinales dans Caenorhabditis elegans; Voir document d’accompagnement sur c. elegans tubulogenèse intestinale)³. Les principes de la biogenèse membranaire polarisée et tubulogenèse sont conservés chez les métazoaires, et un mécanisme moléculaire similaire leur ordonne^1,2,4.

Le système excréteur de c. elegans est constitué de cinq cellules : la cellule excrétoire (EC), cellule canaliculaire (DC), pores cellulaires (PC) et deux cellules de la glande. Ablation des EC, DC ou PC provoque l’accumulation de liquide dans la cavité du corps et l’animaux meurent à un début de stade larvaire⁵. Curieusement, ces trois tubes unicellulaires créer leurs lumières de trois manières différentes : par cellule évidement (EC) ; habillage de cellule couplée avec la formation de jonctions autocellular (PC) ; et de l’enveloppe cellulaire couplé avec autofusion (DC) ; différents mécanismes de la morphogenèse de lumen qui sont toutes conservées phylogénétiquement^6,7. La Communauté européenne, située sur le côté latéral gauche du bulbe pharyngé postérieur, envoie deux extensions latérales qui ramifient les quatre canaux d’étendre vers l’avant et vers l’arrière (sur le côté droit et gauche) jusqu’à l’extrémité du nez du ver et la queue , respectivement (Figure 1)^5,6,8. La Communauté européenne s’étend d’environ 1 µm à 2 x 1 000 µm, ce qui en fait la plus grande cellule chez l’animal. Au niveau intracellulaire, le canal excréteur est un simple tube, généré à partir d’une membrane basale orientée vers le pseudocoelome et en tunnel par une membrane de lumière (endotube). La membrane de lumière canal relie à la membrane de lumière conduit à sa jonction intercellulaire seulement ; les canaux sont par ailleurs BostonMD le long de leur longueur (Figure 1). La membrane de lumière de canal excréteur et son cytosquelette submembraneous sont apicales, définies par leur composition moléculaire qui ressemble à la composition de la membrane apicale et submembraneous cytosquelette des tubes multicellulaires, tels que l’intestin, et d’autres épithéliums (p. ex., plat). Organites cytoplasmiques, y compris les endosomes vésiculaires et autres (p. ex., appareil de Golgi) endomembranes sont distribuées le long du canal. En outre, plusieurs vésicules canaliculaires – soit reliée à la membrane de lumière, et/ou reliées entre elles ou isolé – sont filetés sur le canal cytoplasme^7,8,9,10 . Cette connexion plasma-membrane/canaliculaire dynamique plus développe le système membranaire du canal et contribue aux deux lumen morphogenèse et l’osmorégulation¹⁰. Le canal excréteur ainsi se compose presque entièrement de l’endo – et les membranes plasmiques, fournissant un excellent modèle pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée et la régulation de l’endo-interface membrane plasmique. L’expansion spectaculaire de la membrane apicale au cours de la morphogenèse de canal – dans ce système monocellulaire qui coïncide avec l’extension lumen – permet également d’analyser les problèmes architecturaux qui découlent de la nécessité de stabiliser et de centrer une membrane intracellulaire de lumière . Ce protocole met l’accent sur l’analyse de la morphogénèse structurale du canal tube et de lumen et la dynamique de la membrane intracellulaire ce choix plutôt que sur les signaux qui dirigent les mouvements cellulaires générant la position de la Communauté européenne dans le système excréteur et construire ses liens complexes avec les autres éléments cellulaires (évaluées à⁶).

Un autre avantage du système c. elegans unicellulaires canal pour l’analyse de membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire est sa capacité à séparer, à travers le temps du développement, la production des différentes composantes de ses membranes et jonctions. La ce est né au moment de la fermeture ventrale et s’installe en ventro-latéral du pharynx pendant milieu embryogenèse^5,6,8, au cours de laquelle le branchement et prorogation du délai canal latéral se produisent. Il est suivi par extension antéro-postérieur canal durant l’embryogenèse fin, un processus qui se poursuit dans le stade larvaire L1 (Figure 1). Dans une larve nouvellement éclose, l’embout canalaire postérieur atteint approximativement au milieu du ver, entièrement s’étendant jusqu’à la queue à la fin de la phase L1, période après laquelle le canal s’allonge avec le ver⁸. Croissance de canal active à une vitesse dépassant celle de la croissance de l’animal ainsi se termine au premier stade larvaire, cependant, plus la croissance se produit parallèlement à la croissance de l’animal entier pendant les stades larvaires supplémentaires (L2-4). Ce paramètre fournit l’occasion d’analyser les différentes étapes de la biogenèse de membrane de novo polarisé, indépendamment de la division cellulaire polarisée ou migration. De plus, il permet la séparation de ce processus de l’assemblage des jonctions (qui se produisent chez l’embryon avant l’initiation de lumen) ; leurs besoins exacts en polarisation de la membrane est toujours une question ouverte dans le domaine de la polarité. Enfin, elle sépare uniquement apicale de l’expansion de la membrane basale, ce dernier procédé qui précède le premier dans les canaux excréteurs¹⁰. Le modèle de canal excréteur de c. elegans est donc un complément particulièrement instructif au modèle intestinal qui partage un certain nombre de ces avantages pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée, mais l’exécute dans un contexte multicellulaire (voir le livre qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse³).

Bien que les canaux de type sauvage est ultra-minces tubules dans ce tout petit ver, leurs lumières peuvent être visualized directement par optique Nomarski chez cet animal transparent. En fait, les morphologies mutant canal cystique peuvent être caractérisés chez les animaux non étiquetés à l’aide de faible grossissement dissection microscopie, qui a été utilisé à bon escient en avancer les écrans génétiques pour identifier les gènes impliqués dans la tubulogenèse¹¹. Meilleure visualisation de la morphologie des canaux et la distinction de leurs membranes polarisées, composants du cytosquelette, différents organites intracellulaires et autres structures subcellulaires, cependant, exige que l’étiquetage et de puissance plus élevée fluorescentes microscopie confocale et de dissection. Bien que la structure fine des canaux pose un certain nombre de difficultés pour l’étiquetage et la microscopie, membranes et composants subcellulaires peuvent être distinguées par les molécules spécifiques propres à chaque compartiment et animaux peut être montés en toute sécurité pour la microscopie si certaines précautions sont prises pour éviter d’introduire des artefacts (voir protocole et Discussion). L’étiquetage peut être fait par immunohistochimie dans échantillons fixés ou en générant les vers transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent sous le contrôle de leurs propres ou des promoteurs spécifiques canal excréteurs pour l’imagerie in vivo . Ce protocole décrit la technique de marquage ce dernier (voir le document ci-joint tubulogenèse intestinale des anticorps coloration³).

La possibilité de combiner les études in vivo perte ou gain de-fonction avec in vivo imaging analyse à la seule cellule de niveau tout au long du développement rend le canal excréteur de c. elegans un modèle particulièrement fort pour le moléculaire et analyse cellulaire de tubulogenèse unicellulaires. Écrans génétiques avant ou arrière peuvent être effectuées en commençant par un animal transgénique sauvage ou étiqueté pour identifier les phénotypes de la morphogenèse de canal (par exemple, kystes) et ses défauts de gène sous-jacent. Sinon, ces écrans peuvent commencer avec un phénotype mutant (par exemple, un canal cystique) et identifier les suppresseurs ou exhausteurs de ce phénotype pour identifier les gènes qui interagissent sur le plan fonctionnel avec le gène qui cause le phénotype mutant. L’anomalie génétique provoquant le phénotype mutant peut induire une perte (par exemple, par délétion de gène) ou un gain (par exemple, via une mutation activatrice ou via l’introduction de copies du gène excès) de la fonction étudiée. Transmettre par mutagénèse ou RNAi systématique écrans sont sans a priori sur la fonction des gènes et permettent l’identification objective des gènes impliqués dans la fonction d’intérêt. Compte tenu de la disponibilité de l’ARNi pangénomique alimentation bibliothèques, presque chaque gène peut être facilement renversé par ARNi chez c. elegans, telle qu’un seul gène d’intérêt ou d’un groupe de gènes (par exemple, dans les écrans ciblés) peut également être rapidement sondé par son effet dans une approche de génétique inverse. Afin de démontrer une combinaison possible des approches, nous décrivons ici un écran d’interaction ciblé Arni, commençant par un mutant de gain de fonction kystique canal excréteur, marquées avec la protéine fluorescente verte cytoplasmique canal (GFP). Le phénotype mutant a été généré par la surexpression de MCE-1, un hautement conservée de c. elegans orthologues de la famille de l’éditeur de liens de membrane-actine Ezrin-radixine-moésine (MCE), qui a été impliquée dans la morphogenèse de lumen et membrane Organisation de nombreuses espèces¹². C. elegans MCE-1 se localise aux membranes de lumière des organes internes, tels que le canal excréteur et l’intestin et est nécessaire pour la formation de lumière dans les deux¹³. ERM-1 surexpression recrute excès actine et vésicules de la membrane de lumière de canal, augmentant le flux dans la lumière et de générer un canal cystique court et une membrane de lumière sertie avec l’actine épaissie sous-poil⁹. Le protocole décrit comment générer des souches transgéniques avec canal excréteur-exprimés étiqueté protéines fusion (ou autres protéines) ; Comment réaliser des écrans de RNAi ciblées à partir de ces souches, d’identifier les modificateurs d’un phénotype de canal ; et comment analyser visuellement les résultats de ces écrans dissection et confocale en microscopie par fluorescence, y compris des moyens simples pour quantifier les phénotypes tubulogenèse instructif. Alternative étiquetage techniques ainsi que les détails de l’ARNi, ajusté aux gènes tubulogenèse souvent mortels, se trouvent dans le document qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse³. Toutes les méthodes peuvent être utilisées dans des combinaisons variées pour enquêter sur d’autres questions sur le canal tubulogenèse.

Protocol

1. étiquetant le c. elegans Excretory Canal par des protéines de Fusion fluorescentes 14 Remarque : Voir le document ci-joint sur tubulogenèse intestinale 3 pour l’étiquetage par in situ les anticorps adaptable au canal excréteur de procédures de coloration. Voir le tableau 1 pour des exemples de molécules sont avérées utiles pour la visualisation de c. elegans canal excréteur endo – et …

Representative Results

Ce protocole décrit comment utiliser les canaux excréteurs de c. elegans visuellement et moléculairement analyser tubulogenèse unicellulaires et morphogenèse lumen intracellulaire dans une seule cellule. Pendant leur extension depuis le moment de Mid-l’embryogenèse à l’âge adulte, les quatre canaux excréteurs continuent d’accroître leur basolatérale et membranes apicales/lumière avec leur système endomembranaire canaliculaire et endosomes, offrant un modèle un…

Discussion

Polyvalence génétique c. elegans , transparence, plan simple corps et lignage cellulaire invariant rendent un excellent modèle pour l’analyse de la morphogénèse. Ce protocole décrit comment combiner des manipulations génétiques standards et imagerie études pour profiter de 2 micron minces canaux excréteurs c. elegans afin d’étudier la membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire dans un tube de cellule unique.

L’étiquetage
Les …

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)