C. Elegans Excretory Kanal als Modell für die intrazelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis in einer einzelnen Zelle: Kennzeichnung von GFP-Fusionen, RNAi Interaktion Bildschirm und Imaging
Summary
Der C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ist ein einzigartiges einzellige Modell für die optische in-Vivo -Analyse der de Novo polarisiert Membran Biogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination aus standard genetische/RNAi und imaging-Ansätze, zur Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen Regie einzelligen Tubulogenesis und apikale Membran und Lumen Biogenese anpassungsfähig.
Abstract
Die vier C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle sind engen Röhren, die durch die Länge des Tieres aus einer einzigen Zelle mit fast ebenso weit ausgedehnten intrazelluläre Endotubes, die aufbauen und stabilisieren das Lumen mit einer Membran und Submembraneous erweitert Zytoskelett der apikalen Charakter. Die Ausscheidungsorgane Zelle erweitert seine Länge ca. 2.000 Mal, um diese Kanäle, so dass dieses Modell für die in-Vivo -Beurteilung der de Novo polarisiert Membran Biogenese, intrazelluläre Lumen Morphogenese eindeutig zu generieren und einzelligen Tubulogenesis. Die hier vorgestellten Protokoll zeigt, wie Sie Standard Beschriftung, Gewinn – und Verlust-der-Funktion genetische oder RNA-Interferenz (RNAi) kombinieren-, und mikroskopische Ansätze, dieses Modell optisch zu sezieren und funktionell analysiert diese Prozesse auf molekularer Ebene zu verwenden. Als ein Beispiel für eine Kennzeichnung Ansatz beschreibt das Protokoll die Generation von transgenen Tieren mit fluoreszierenden Fusionsproteine für live-Analyse des Tubulogenesis. Als ein Beispiel für eine genetische Ansatz unterstreicht es Eckpunkte eines visuellen RNAi-basierten Interaktion Bildschirm entwickelt, um eine zystische Kanal Gain-of-Function-Phänotyp ändern. Die spezifischen Methoden beschrieben sind wie: beschriften und visualisieren die Kanäle zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine; eine gezielte RNAi-Bibliothek zu konstruieren und strategisch RNAi screening für die molekulare Analyse der Kanal Morphogenese; Änderungen der Kanal Phänotypen visuell zu beurteilen; Punkten sie durch sezieren Fluoreszenz-Mikroskopie; subzelluläre Kanal Komponenten mit höherer Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu charakterisieren; und Quantifizierung der visuelle Parametern. Der Ansatz eignet sich für den Prüfer, der unter Ausnutzung des C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanals für die Identifizierung und Charakterisierung von Genen beteiligt die phylogenetisch konserviert Prozesse der intrazellulären Lumen und einzelligen interessiert ist Rohr-Morphogenese.
Introduction
Alle inneren Organe bestehen aus Rohren, entscheidend für ihre viele verschiedenen Funktionen, wie z. B. den Transport und Austausch von Gasen, Flüssigkeiten und Nährstoffen und die Ausscheidung von Stoffwechselschlacken. Ihre polarisierten Charakter, mit deutlichen lumenal und apikalen Membranen, ist auf diese spezifische Funktionen angepasst, und Mängel in der Biogenese ihrer Endo und Plasmamembran-Systeme sind eine häufige Ursache von Krankheiten1,2. Die Mehrheit der Rohre des Gefäßsystems und der inneren Organe sind mehrzelligen und bilden ein Lumen intercellularly; jedoch können, einzellige Röhren, die das Lumen intrazellulär bilden, z. B. so viel wie 30 – 50 % der menschlichen Kapillare Betten2darstellen. Die polarisierten Membranen der Multi- und einzelligen Röhren ähneln sich in Zusammensetzung, obwohl ihre Microdomains basierend auf das Rohr bestimmte Funktion (z.B., Ausscheidungsorgane Kanal Canaliculi gegen Darm Mikrovilli in Caenorhabditis unterscheiden können Elegans; siehe Papier auf C. Elegans Darm Tubulogenesis begleiten)3. Die Grundsätze der polarisierten Membran Biogenese und Tubulogenesis sind bei Metazoen konserviert, und eine ähnliche molekulare Maschinerie leitet sie1,2,4.
Die Ausscheidungsorgane C. Elegans besteht aus fünf Zellen: die Ausscheidungsorgane Zelle (EC), Kanal Zellen (DC), pore Zelle (PC) und zwei Drüsenzellen. Ablation der EG, DC oder PC verursacht Flüssigkeitsansammlung in der Körperhöhle und die Tiere sterben an einer frühen Larvenstadium5. Faszinierend, diese drei einzelligen Rohre erstellen ihr Lumen auf drei verschiedene Arten: von Zelle Aushöhlung (EG); Zelle Verpackung gekoppelt mit Autocellular Kreuzung Bildung (PC); und durch die Zelle Umhüllung in Verbindung mit Autofusion (DC); verschiedene Mechanismen der Lumen Morphogenese, die alle phylogenetisch konserviert6,7. Die EG, befindet sich auf der linken lateralen Seite der hinteren Rachenraum Lampe, sendet zwei seitliche Erweiterungen aus, die die vier Kanäle verzweigen sich vorangegangene erweitern und nach hinten (auf der rechten und linken Seite) bis zur Spitze des der Wurm Nose und tail , bzw. (Abbildung 1)5,6,8. Die EG erstreckt sich von etwa 1 µm bis 2 x 1.000 µm, so dass es die größte Zelle im Tier. Auf subzellulärer Ebene ist der Ausscheidungsorgane Kanal ein einfaches Rohr, generiert aus einer Basalmembran auf das Pseudocoelom gerichtet, und durch eine lumenal Membran (Endotube) getunnelt. Die Kanal lumenal Membran verbindet der Kanal lumenal Membran an der nur interzellulären Kreuzung; Ansonsten sind die Kanäle junctionless entlang ihrer Länge (Abbildung 1). Die Ausscheidungsorgane Kanal lumenal Membran und seine Submembraneous Zytoskelett sind apikale, definiert durch ihre molekulare Zusammensetzung, die die Zusammensetzung der apikalen Membran und Submembraneous Zytoskelett mehrzelligen Röhren, wie der Darm ähnelt, und von anderen Epithelien (z.B.Wohnung). Zytoplasmatischen Organellen, einschließlich Endosomal vesikuläre und andere (z.B.Golgi) Endomembranes entlang der Länge des Kanals verteilt sind. Darüber hinaus sind mehrere canalicular Vesikel – verbunden mit der lumenal Membran und/oder miteinander verbunden oder isoliert – durch den Kanal Zytoplasma7,8,9,10 Gewinde . Diese dynamische Plasma-Membran/canalicular Verbindung weiter erweitert den Kanal-Membran-System und trägt zur sowohl Lumen Morphogenese und Muskeltätigkeit10. Die Ausscheidungsorgane Kanal besteht somit fast ausschließlich aus Endo und Plasmamembranen, die ein hervorragendes Modell für die Analyse der polarisierten Membran Biogenese und die Regulierung der Endo-Plasmamembran Schnittstelle. Die drastische Ausweitung der apikalen Membran während Kanal Morphogenese – in diesem einzellige System deckungsgleich mit Lumen Erweiterung – ermöglicht auch die architektonische Probleme, die durch die Notwendigkeit, zu stabilisieren und in der Mitte einer intrazellulären lumenal Membran zu analysieren . Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Analyse der Kanal Rohr und Lumen der strukturellen Morphogenese und der intrazellulären Membran Dynamik für diesen Prozess nicht auf die Signale, die die Zelle Bewegungen lenken, die in der Standpunkt der EG zu erzeugen die Ausscheidungsorgane und seiner komplizierten Verbindungen mit anderen zellulären Elementen (rezensiert in6) zu konstruieren.
Ein weiterer Vorteil von C. Elegans einzellige Kanalsystem für die Analyse von polarisierten Membran und intrazellulären Lumen Biogenese ist seine Fähigkeit, durch Entwicklungszeit, die Generation der verschiedenen Komponenten der Membranen zu trennen und Kreuzungen. Die EG entsteht zum Zeitpunkt der ventralen Schließung und siedelt sich Ventro-seitlich des Rachens während Mitte Embryogenese5,6,8, während die Verlängerung der Seitenkanal und Verzweigungen auftreten. Das anterior-posterioren Kanal Erweiterung in der späten Embryogenese, einen Prozess folgt, die weiterhin in der L1-Larvenstadium (Abbildung 1). In einer frisch geschlüpften Larve die hinteren Kanal Spitze erreicht ungefähr in die Mitte des Wurms, voll Verlängerung am Schwanz am Ende der Phase L1, nach welcher Zeit des Kanals zusammen mit dem Wurm8verlängert. Aktiven Kanal Wachstum mit einer Geschwindigkeit über das Wachstum des Tieres so endet im ersten Larvenstadium, allerdings weiter Wachstum tritt gleichzeitig mit dem Wachstum des gesamten Tieres während die weiteren Larvenstadien (L2-4). Diese Einstellung bietet die Möglichkeit, die verschiedene Stufen der de Novo polarisiert Membran Biogenese unabhängig von polarisierten Zellteilung oder Migration zu analysieren. Außerdem ermöglicht es die Trennung dieses Prozesses von der Versammlung der Knotenpunkte (die im Embryo vor Lumen Einleitung auftreten); Ihre genauen Anforderungen in Membran Polarisierung ist immer noch eine offene Frage im Feld Polarität. Schließlich trennt es eindeutig apikalen von Basalmembran Expansion, das letztere Verfahren vor der ehemaligen in der Ausscheidungsorgane Kanäle10. Das C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal Modell ist daher eine besonders informative Ergänzung mit dem Darm Modell, das eine Reihe von diesen Vorteilen für die Analyse von polarisierten Membran Biogenese teilt aber führt ihn in einer mehrzelligen Einstellung (siehe die begleitenden Paper über den Darm Tubulogenesis3).
Obwohl Wildtyp Kanäle ultradünnen Tubuli in diesem winzigen Wurm sind, können ihre Lumen vi sein.Sualized direkt von Nomarski Optik in diesem transparenten Tier. In der Tat können mutierten zystische Kanal Morphologien charakterisiert werden, in unbeschrifteten Tiere mit geringer Vergrößerung sezieren Mikroskopie, die mit großer Wirkung in vorwärts genetischer Bildschirme verwendet wurde, um an Tubulogenesis11beteiligten Gene zu identifizieren. Verbesserte Visualisierung von der Morphologie der Kanäle und Unterscheidung von ihren polarisierten Membranen, Zellskelett Komponenten, verschiedene intrazelluläre Organellen und andere subzellulären Strukturen, jedoch erfordert, Kennzeichnung und höher macht Leuchtstofflampen sezierenden und konfokalen Mikroskopie. Obwohl die Kanäle Feinstruktur eine Reihe von Schwierigkeiten für die Kennzeichnung und Mikroskopie stellt, Membranen und subzelluläre Komponenten unterschieden werden, über die bestimmte Moleküle, die einzigartig für jedes Fach und Tiere können sicher für die Mikroskopie montiert werden, wenn bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, zu vermeiden Einführung Artefakten (siehe Protokoll und Diskussion). Kennzeichnung kann erfolgen durch Immunhistochemie in festen Proben oder durch die Erzeugung transgener Würmer mit dem Ausdruck fluoreszierende Fusionsproteine unter die Kontrolle über ihre eigenen oder Ausscheidungsorgane Kanal-spezifische Promotoren für in-Vivo Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung Verfahren (siehe begleitende Papier auf intestinale Tubulogenesis für Antikörper Färbung3).
Die Fähigkeit, in Vivo Verlust oder Gewinn-of-Function-Studien mit in-Vivo imaging-Analyse auf die einzelne Zelle level in der gesamten Entwicklung macht den C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ein besonders starkes Modell für die molekulare und zelluläre Analyse der einzelligen Tubulogenesis. Vorwärts oder rückwärts genetische Bildschirme können durchgeführt werden, beginnend mit einem Wildtyp oder beschrifteten transgenen Tieres Kanal Morphogenese Phänotypen (z.B. Zysten) zu identifizieren und ihre zugrunde liegenden Gendefekten. Alternativ können solche Bildschirme beginnen mit einem mutierten Phänotyp (z.B. eine zystische Kanal) und Unterdrücker oder Enhancer von diesen Phänotyp zur Identifizierung von Genen, die funktionell interagieren mit dem Gen verursacht des mutierten Phänotyps zu identifizieren. Der Gendefekt verursacht des mutierten Phänotyps kann induzieren einen Verlust (z.B. über gen löschen) oder ein Gewinn (z.B. über eine aktivierende Mutation oder über die Einführung des überschüssigen gen Kopien) der untersuchten Funktion. Vorwärts Mutagenese oder systematische RNAi-Screens sind ohne Vorurteile auf Genfunktion und die unvoreingenommene Identifizierung von Genen, die in der Funktion des Interesses ermöglichen. Angesichts der Verfügbarkeit der genomweiten RNAi Fütterung Bibliotheken kann fast jedes gen leicht durch RNAi in C. Elegans, abgerissen werden, dass jedes einzelne gen des Interesses oder eine Gruppe von Genen (z. B.in gezielte Bildschirme) auch schnell sondiert werden kann für ihre Wirkung in einem reverse Genetik-Ansatz. Um eine mögliche Kombination von Ansätzen zu demonstrieren, beschreiben wir hier einen gezielte RNAi Interaktion Bildschirm, beginnend mit eine zystische Ausscheidungsorgane Kanal Gain-of-Function-Mutante mit zytoplasmatischen Kanal grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gekennzeichnet. Die mutierte Phänotyp wurde durch Überexpression des Erm-1, einer hoch konservierten C. Elegans generiert Ortholog der Membran-Aktin Linker Familie Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die in Lumen Morphogenese und Membran verwickelt Organisation in vielen Arten12. C. Elegans ERM-1 lumenal Membranen der inneren Organe, wie z. B. die Ausscheidungsorgane Kanal und des Darms, lokalisiert und ist erforderlich für Lumen Bildung in beiden13. ERM-1 Überexpression Rekruten überschüssige Aktin und Vesikeln der Kanal lumenal Membran, Erhöhung der Fluss in das Lumen und generieren einen kurzen zystische Kanal und einem gekräuselten lumenal Membran mit verdickten Aktin Unterwolle9. Das Protokoll beschreibt, wie Sie transgene Linien mit Ausscheidungsorgane Kanal ausgedrückt erzeugen mit der Bezeichnung Fusion Proteine (oder andere Proteine); Gewusst wie: ausführen eine gezielte RNAi-Screens ausgehend von dieser Stämme, Modifikatoren des Phänotyps Kanal zu identifizieren; und wie Sie visuell analysieren die Ergebnisse solcher Bildschirme von sezierenden und konfokale Fluoreszenzmikroskopie, einschließlich einfache Möglichkeiten, um informative Tubulogenesis Phänotypen zu quantifizieren. Alternative Techniken und die Details der RNAi, abgestimmt auf die oft tödliche Tubulogenesis Gene, Kennzeichnung finden Sie in der begleitenden Zeitung am Darm Tubulogenesis3. Alle Methoden können in verschiedenen Kombinationen für die Untersuchung weiterer Fragen auf Kanal Tubulogenesis verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. Elegans genetische Flexibilität, Transparenz, einfache Körper Plan und invariante Zelle Abstammung machen es ein hervorragendes Modell für die Analyse der Morphogenese. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie kombinieren standard genetische Manipulationen und Bildgebung Studien nutzen die 2 Mikrometer dünn C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanäle um polarisierte Membran und intrazellulären Lumen Biogenese in einer Einzelzelle Röhre zu studieren.
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Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (Medical Center der Universität von Rochester, Rochester, New York, USA) und dem Caenorhabditis Genetik Center, gefördert durch die National Institutes of Health, Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440). Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des NIH GM078653, MGH ist 224570 und SAA-223809, V.G.
Materials
| Cloning | |||||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |||
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |||
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |||
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |||
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |||
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |||
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |||
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |||
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |||
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |||
| Equipments | |||||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |||
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |||
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |||
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |||
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |||
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |||
| C. elegans related1 | 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||||
| LB Medium and plates2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |||
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |||
| M9 Medium2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| NGM plates 2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| RNAi plates3 | 3see reference60 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |||
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |||
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |||
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |||
| Bacteria | |||||
| OP50 bacteria | CGC | ||||
| HT115 bacteria | CGC | ||||
| Genome-wide RNAi libraries | |||||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) | Source BioScience | ||||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) | Source BioScience | ||||
| Imaging related | |||||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |||
| Materials | |||||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |||
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |||
| Microscope coverslips (22×22-1） | Fisher Scientific | Cat. no. 12-542-B | |||
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |||
| Equipment | |||||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) | |||||
Riferimenti
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