توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب<em> حيدرة</em
Summary
من خلال علاج مزدوج مع الكولشيسين، السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام، يمكن أن تتولد هيدرا فولغاريس الخالية من الأعصاب. هذه هيدرا لا يمكن تغذية أو إيستست من تلقاء نفسها. وتصف هذه الورقة طريقة محسنة للصيانة طويلة الأمد لل هيدرا فولغاريس العصبية الحرة في المختبر.
Abstract
وتشمل سلالة الخلايا الخلالية من هيدرا الخلايا الجذعية متعددة الخلايا، ومشتقاتها: خلايا الغدة، الخلايا النيماتية، والخلايا الجرثومية، والخلايا العصبية. يمكن القضاء على الخلايا الخلالية من خلال اثنين من العلاجات متتالية مع الكولشيسين، وهو السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام، وبالتالي محو إمكانية تجديد الخلايا المتمايزة التي يتم استخلاصها من الخلايا الجذعية الخلالي. وهذا يسمح لتوليد هيدرا التي تفتقر إلى الخلايا العصبية. لا يمكن لعنبية خالية من الأعصاب فتح فمها لتغذية، إجيست، أو تنظيم الضغط الاسموزي. ومع ذلك، يمكن لهذه الحيوانات البقاء على قيد الحياة ويتم استزراعها إلى أجل غير مسمى في المختبر إذا كانت تتغذى بانتظام وتزرع. عدم وجود الخلايا العصبية يسمح لدراسات دور الجهاز العصبي في تنظيم سلوك الحيوان وتجديد. البروتوكولات التي نشرت سابقا للصيانة خالية من الأعصاب هيدرا تنطوي على التقنيات التي عفا عليها الزمن مثل الفم بيبتينغ مع ميكروبيبيت اليد سحبهاإيبس لتغذية وتنظيف هيدرا . هنا، يتم تقديم بروتوكول محسن لصيانة هيدرا خالية من الأعصاب. وتستخدم ملقط غرامة يميل لإجبار فتح الفم وإدراج أرتيميا طازجة قتل. بعد تغذية القوة، يتم مسح تجويف الجسم للحيوان مع المتوسطة الطازجة باستخدام حقنة وإبرة تحت الجلد لإزالة المواد عسر الهضم، المشار إليها هنا باسم "التجشؤ". هذه الطريقة الجديدة للتغذية القوة والتجشؤ هيدرا خالية من الأعصاب من خلال استخدام ملقط والمحاقن يلغي الحاجة إلى الفم بيبتينغ باستخدام اليد سحبت نصائح ميكروبيبيت. وبالتالي يجعل العملية أكثر أمانا وأكثر فعالية بكثير الوقت. للتأكد من أن الخلايا العصبية في هيبوستوم تم القضاء عليها، يتم إجراء المناعية باستخدام المضادة للتييروسين-توبولين.
Introduction
الجهاز العصبي من هيدرا يتكون من شبكة العصب، مع الخلايا العصبية المرتبطة كل من طبقات الأنسجة الظهارية 1 . صافي العصب هو أكثر كثافة في هيبوستوم وسويقة وأقل كثافة في العمود الجسم 2 . الخلايا العصبية تنشأ من الخلايا الجذعية الخلالية، والتي هي الخلايا الجذعية متعددة الاختصاصات التي تؤدي إلى خلايا إفرازية، الخلايا النيماتية، والخلايا الجرثومية، والخلايا العصبية 1 . فمن الممكن للقضاء على الخلايا الخلالية من هيدرا فولغاريس من خلال العلاج مع الكولشيسين 3 ، 4 ، السموم المشتقة من النبات الذي يقتل الخلايا الانقسام. على الرغم من أن الكولشيسين تم العثور على تثبيط البلمرة ميكروبيبول في الكائنات الحية الأخرى، وقد أظهرت دراسة سابقة أن الأنابيب الدقيقة موجودة في هيدرا طوال العلاج بأكمله، مما يشير إلى أن الكولشيسين لا يتصرف بهذه الطريقة في هيدرا 3 . آخر ستيوحي أودي أن الكولشيسين لا يربط بكفاءة إلى توبولين في بعض الكائنات الحية، بما في ذلك تيترايمينا بيريفورميس، زي مايس، كلاميدوموناس ، و ششيزوساشاروميسز بومب، والتي قد تفسر هذا الاختلاف 5 . العلاج الكولشيسين يدفع البلعمة من الخلايا الخلالي من قبل الخلايا الظهارية الأديم الباطن 3 وبالتالي يسمح لخلق الحيوانات التي تفتقر إلى الخلايا العصبية وخلايا الغدة، والخلايا النيماتية. ومن غير الواضح لماذا الخلايا الخلالية هي عرضة بشكل خاص لعلاج الكولشيسين. وبالنظر إلى أن كل من الخلايا الخلالية ما بعد الإنقسامية ونسب الخلايا الجذعية الخلالية تضررت و فاجوسيتوسد، خلص كامبل إلى أن الكولشيسين لا يؤثر بشكل مباشر على النشاط الانقسامي 3 . والجدير بالذكر أن العلاج الكولشيسين يعمل بشكل جيد في هيدرا فولغاريس، ولكن ثبت أن لا تعمل كذلك في الأنواع الأخرى، مثل هيدرا أوليغاكتيس 6 . </إم> يمكن استخدام المعالجة المعدلة مع الكولشيسين وهيدروكسي يوريا لإنتاج هيدرا فيريديس خالية من الأعصاب 7 . هيدرا خالية من الأعصاب (كما يشار إليها أحيانا باسم " هيدرا الظهارية" 8 ) هي بالتالي أداة مفيدة لدراسة أدوار هذه الأنواع من الخلايا المتخصصة من النسب الخلالي خلية في التوازن الأنسجة وتجديد.
هيدرا قد يكون المثال الوحيد المعروف للحيوان قادر على العيش من دون الجهاز العصبي. هيدرا خالية من الأعصاب بمثابة نموذج مفيد بشكل خاص لتشريح دور الشبكة العصبية في تنظيم هيدرا التجدد والتوازن، والسلوك. على سبيل المثال، إدخال الخلايا الخلالية في هيدرا خالية من الأعصاب عن طريق التطعيم سمح لتوصيف التمايز الخلايا العصبية كما محددة للغاية المنطقة 9 . وعلاوة على ذلك، لأن هيدرا خالية من الأعصاب يمكن تجديد، فإنهاتمكن من التحقيق في مسارات تجديد بديلة للجهاز العصبي المستقل. أحد الأمثلة على ذلك هو الخلايا العصبية القمية وتكوين الرأس، والتي تبين أنها تعتمد على وظيفة نوكس-2 في الجهاز العصبي في ويلديب هيدرا ، ولكن يبدو أنها قابلة للاستبدال في هيدرا خالية من الأعصاب، مما يشير إلى أنه قد يكون هناك بديل عملية تجديد الرأس 10 –
كما تم استخدام هيدرا خالية من الأعصاب لدراسة التعبير عن الخلايا الظهارية وتنظيم الجينات العصبية والعصبية بعد فقدان الخلايا العصبية 11 . هيدرا خالية من الأعصاب لا تظهر انفجارات انفجارات عفوية 12 ، مشيرا إلى أن هذه الرشقات ينظمها الجهاز العصبي. ومع ذلك، عقد هيدرا دو الخالية من الأعصاب، والتعاقد ردا على معسر العمود الجسم مع ملقط، مما يشير إلى أن تقلص في استجابة للمحفزات الميكانيكية بوساطة اقتران ثروغ تقاطعات الفجوة في الخلايا الظهارية، في حين يتم بوساطة سلوك مقلص عفوية عن طريق اقتران من خلال تقاطعات الفجوة في الخلايا العصبية 13 .
هيدرا خالية من الأعصاب لا تفتح أفواههم عندما قدمت مع الطعام أو انخفاض الجلوتاثيون 3 ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الحسية ضرورية للكشف عن وجود الطعام وإشارة الفم لفتح. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن شبكة العصب أن تلعب دورا في استشعار الضغط الاسموزي، لأن الحيوانات الخالية من الأعصاب غير قادرة على تنظيم مستقل الضغط الهيدروستاتيكي الداخلي من خلال فتح الفم، مما تسبب في مظهرها مثل البالون مميزة 3 ، 4 ( الشكل 1B ). تنظيم الضغط الهيدروستاتيكي في هيدرا الخالية من الأعصاب عن طريق الانكماش اليدوي المتكرر أدى إلى فقدان بعض التشكل غير طبيعي في العمود السفلي والجسم. ومع ذلك، أدى الانكماش المزمن إلى تداخل مع النمو، إلأوغاتيون، في مهدها، وتنظيم الأنسجة 8 .
على الرغم من أن هيدرا خالية من الأعصاب غير قادرة على إطعام و إيستست من تلقاء نفسها، فمن الممكن للحفاظ عليها إلى أجل غير مسمى في المختبر عن طريق تغذية القوة يدويا والتجشؤ كل حيوان. وقد وصفت المنشورات السابقة أساليب تغذية القوة والتجشؤ هيدرا خالية من الأعصاب، ولكن هذه البروتوكولات تنطوي على استخدام نصائح ميكروبيبيت التي يجب أن تكون اليد سحبت بعناية إلى الحجم المناسب، فضلا عن استخدام الناطقة بلسان متصلة ماصة بواسطة أنابيب 14 . هنا، يتم وصف طريقة أبسط وأكثر أمنا، وأكثر كفاءة في الوقت للتغذية والتجشؤ.
وبالإضافة إلى ذلك، شملت الدراسات السابقة التحقق من عدم وجود الخلايا العصبية من خلال تفكك الحيوانات الثابتة في الخلايا الفردية وفحص التشكل الخلية 3 ، 4 ، 15 . Hتم استخدام المناعية مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد التيروزينات الكربوكسيل-محطة من ألفا-توبولين كوسيلة مجانية لتطهير للتحقق من نضوب الخلايا العصبية في 13 ، 16 هايبوستوم. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا العصبية في السويق يمكن أيضا أن تصور باستخدام هذا الأجسام المضادة 13 ، ولكن هذه الخلايا العصبية وكذلك تلك الموجودة في عمود الجسم هي أكثر صعوبة لجعل بها. في حين أن المناعية كافية لتأكيد عدم وجود الخلايا العصبية في هايبوستوم ولا تتطلب الخبرة على نوع الخلايا التشكل، فإنه لا يمكن أن تستخدم للتحقق من عدم وجود الخلايا الجذعية الخلالي والمشتقات الأخرى من هذه الخلايا. التفكك والدراسات مورفولوجيا الخلية هي أكثر صرامة ويمكن أن تعطي حسابا كمي لأعداد كل نوع من الخلايا المتبقية بعد كل مرحلة من مراحل العلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هيدرا الخلايا الخلالي يمكن القضاء عليها من خلال علاج الكولشيسين المزدوج 3 ، 4 . في الأيام التالية للعلاج الأول، فمن الأهمية بمكان لمنع الاتصال بين هيدرا الفردية لتجنب الانصهار من قطع هيدرا في هيدرا مشوهة. أيضا، الحي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور ديك كامبل (جامعة كاليفورنيا في إيرفين) للمناقشات حول البروتوكول الأصلي لتوليد والحفاظ على الحيوانات الخالية من الأعصاب، والسيدة روي وانغ للمساعدة في التكيف مع حقنة وتقنية الإبرة، والسيدة دانيال هاغستروم والدكتور روب ستيل (أوك إيرفين) للتعليق على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل رسيسا و نسف منحة كمي-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
Riferimenti
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
