神経フリーの生成と長期維持<em>ヒドラ</em
Summary
コルヒチンによる二重治療により、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素である神経を含まないハイドラ尋常性疣贅が生成され得る。これらのヒドラは自分自身で食べることはできません。この論文では、研究室で神経フリーのヒドラ・ブルガリスの長期的な維持のための改善された方法について述べる。
Abstract
Hydraの間質細胞系譜には、多分化能性幹細胞およびその誘導体（腺細胞、線虫細胞、生殖細胞および神経細胞）が含まれる。間質細胞は、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチンを用いて2回連続して処理することにより排除することができ、間質幹細胞に由来する分化細胞の再生可能性を消去する。これは、神経細胞を欠いたヒドラの生成を可能にする。神経を含まないポリープは、浸透圧を供給し、排泄し、または調節するためにその口を開くことができない。しかし、そのような動物は、定期的に力を与えて餌をつけた場合、生存し、実験室で無期限に培養することができる。神経細胞の欠如は、動物の行動および再生を調節する際の神経系の役割の研究を可能にする。以前に公開された神経を含まないヒドラの維持のためのプロトコールは、手で引いたマイクロピペットを用いた口のピペット操作ヒドラを飼い 、清掃する。ここでは、神経を含まないヒドラの維持のための改善されたプロトコールが導入されている。細く絞った鉗子を使用して口を強制的に開け、新しく殺されたアルテミアを挿入する。強制給餌後、動物の体腔をシリンジおよび皮下注射針を用いて新鮮な培地でフラッシュして未消化物質を除去する（ここでは「バフィング」と呼ぶ）。鉗子とシリンジを使用して神経を含まないハイドラを強制送達するこの新しい方法は、手で引っ張ったマイクロピペットチップを用いた口のピペット操作の必要性を排除します。したがって、プロセスをより安全にし、大幅な時間効率化を実現します。下垂体内の神経細胞が確実に排除されるように、抗チロシン – チューブリンを用いた免疫組織化学を行う。
Introduction
Hydraの神経系は神経網で構成されており、両方の上皮組織層に関連したニューロンがある。神経ネットは、低体温では密度が高く、体節では密度が低い。神経細胞は、分泌細胞、線虫細胞、生殖細胞およびニューロンを生じる多能性幹細胞である間質幹細胞に由来する。分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチン3,4 で処理することにより、 ヒドラ・ブルガリス（Hydra vulgaris）の間質細胞を排除することが可能である。コルヒチンは他の生物の微小管重合を阻害することが判明していますが、これまでの研究では、治療全体を通して微小管がヒドラに存在し、コルヒチンがHydra 3でこのように作用しないことが示唆されています。もう一歩udyは、 Tetrahymena pyriformis、Zea mays、ChlamydomonasおよびSchizosaccharomyces pombeを含むいくつかの生物において、コルヒチンがチューブリンに効率的に結合しないことを示唆している。コルヒチン処置は、内胚葉上皮細胞による間質細胞の食作用を誘導し、したがって、神経細胞、腺細胞および線維細胞がない動物の作製を可能にする。間質細胞が特にコルヒチン処置の影響を受けやすい理由は不明である。 Campbellは、有糸分裂後の間質細胞と間質幹細胞系統が損傷し貪食されていることを考えると、コルヒチンは有糸分裂活性に直接影響しないと結論している3 。注目すべきは、コルヒチン治療はハイドラ・ブルガリ（Hydra vulgaris）において良好に機能するが、 ヒドラ・オリゴアクシス（Hydra oligactis） 6のような他の種においてもうまく機能しないことが示されている。 </コルヒチンおよびヒドロキシ尿素を用いた改変治療は、神経を含まないHydra viridis 7を産生するために使用することができる。したがって、神経を含まないヒドラ （「上皮性ヒドラ 」とも呼ばれることもある）は、組織ホメオスタシスおよび再生における間質細胞系列からのこれらの特殊な細胞型の役割を研究するための有用なツールである。
ヒドラは、神経系なしで暮らすことができる動物の唯一の既知の例であるかもしれない。神経を含まないヒドラは、 ヒドラの再生、恒常性、および行動を調節する際に神経網の役割を解剖するのに特に有用なモデルとして役立つ。例えば、移植を介して間質細胞を神経を含まないHydraに導入することにより、神経細胞の分化を特徴付けることができた。さらに、神経を含まないヒドラは再生することができるため、代わりの、神経系に依存しない再生経路の調査を可能にする。そのような例の1つは、野生型ヒドラの神経系におけるcnox-2機能に依存することが示されているが、神経を含まないヒドラには存在しないようであり、代替的な頭部再生プロセスが存在し得ることを示唆する先端神経形成および頭形成である10 。
神経を含まないヒドラはまた、神経新生11の喪失後に、上皮細胞の発現および神経原性および神経伝達遺伝子の調節を研究するために使用されている11 。神経を含まないヒドラは自発収縮バースト12を示さず、これらのバーストは神経系によって調節されることを示している。しかし、神経を含まないHydraは体の柱を鉗子で挟むことに応答して収縮し、機械的刺激に応答する収縮はカップリングスルーによって媒介されることを示唆しているghギャップジャンクションを介して結合するが、自然収縮挙動は神経細胞のギャップジャンクションを介して結合することによって媒介される13 。
神経を含まないヒドラは、食物や還元型グルタチオン3を与えられても口を開けません。これは、食物の存在を検出して口を開けるように感覚ニューロンが必要であることを示唆しています3 。加えて、神経網は、開口部から内部の静水圧を自律的に調節することができず、特徴的な風船状の外観を呈する（ 図1B ）ため、浸透圧を感知する役割を果たすと思われる。頻繁な手動収縮による神経を含まないヒドラにおける静水圧の調節は、低体温および身体の柱におけるいくつかの異常な形態の喪失につながった。しかし、慢性的なデフレは成長への干渉をもたらした養子縁組、発芽、および組織組織8 。
神経を持たないヒドラは自分で食べることはできませんが、手動で動物を強制的に餌を与えて飼育することで、実験室で無期限に維持することは可能です。以前の刊行物は、無給餌のHydraを強制的に給餌する方法を記載しているが、これらのプロトコールは、マイクロピペットチップを使用することを必要としており、これを適切なサイズに注意深く引っ張る必要があり、チュービング14によってピペットに接続されたマウスピースを使用する。ここでは、より単純で、より安全で、より時間効率的な、給餌および飼育の方法が記載されている。
さらに、以前の研究では、固定された動物を個々の細胞に解離させて神経細胞が存在しないかどうかを検査し、細胞の形態学を調べた3,4,15）。 Hアルファ – チューブリンのチロシン化カルボキシル末端に対するモノクローナル抗体による免疫組織化学を、hypostome 13,16におけるニューロンの枯渇を確認するための浸軟の補完的方法として用いた。これまでの研究では、この抗体13を用いて、花柄のニューロンも視覚化することができることが示されているが、これらのニューロンは、身体の欄のものと同様に、免疫組織化学は、hypostomeにおける神経細胞の不在を確認するのに十分であり、細胞型形態に関する専門知識を必要としないが、間質幹細胞およびこれらの細胞の他の誘導体の欠如をチェックするために使用することはできない。解離および細胞形態学の研究はより厳密であり、治療の各段階の後に残っている各細胞型の数を定量的に説明することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ハイドラ間質細胞は、二重コルヒチン処理により除去することができる3,4 。最初の治療の後の日には、個々のヒドラ間の接触を防ぎ、 ヒドラの断片が変形したヒドラに融合するのを避けることが不可欠です。また、第2のコルヒチン処置は、そのような動物から残りの間質細胞を排除するのに十分ではない可能性があるため、最初の処置の後に無…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はDick Campbell博士（UC Irvine）に、神経を含まない動物の生成と維持のための元のプロトコール、注射器と注射針技術の適応に関するRui Wang、Danielle HagstromとDr. Rob Steele （UC Irvine）のコメントを寄稿した。この研究は、RCSAおよびNSFグラントCMMI-1463572によって支持された。
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
Riferimenti
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