نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة
Summary
مروج تعبير تحاليل ضرورية لتحسين فهم تنظيم الجينات والتعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. وهنا نقدم بروتوكول لتحديد وعزل واستنساخ مروج نبات. علاوة على ذلك، يصف لنا وصف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة.
Abstract
تسلسل المراحل الأولى من الجينات ترميز تسلسلات توصف بأنها متواليات المروج. دراسة أنماط التعبير من المروجين هامة جداً في فهم تنظيم الجينات وأنماط التعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في نمط التعبير الزمانية المكانية مروج إنشائها (نين) رهيزوبيال الخاصة بالتكافل العقيدات فاصولياء الشائع في جذور شعر المحورة وراثيا. استخدام قواعد بيانات الجينوم المصنع وأدوات التحليل التي حددناها، معزولة، واستنساخ المروج الشائع P. نين في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك β-glucuronidase (غوس) غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر rhizogenes المتبعة التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر سم إيه تو في 10 إلى 12 يوما بعد التحول. بعد ذلك، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في جذور شعر طعمت على فترات دورية للتطعيم بعد. وتبين النتائج لدينا يصور بنشاط غوس أن المروج نين نشطة أثناء عملية نودوليشن. معا، على هذا البروتوكول يوضح كيفية تحديد وعزل واستنساخ وتميز مروج نبات في جذور شعر الحبة المشتركة. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.
Introduction
مروجي هي أدوات هامة البيولوجية الجزيئية التي تلعب دوراً حاسما في فهم تنظيم الجينات للفائدة. المروجين تسلسل الحمض النووي الموجود في أعلى النهر من الترجمة تسلسل بدء كودون من الجينات وأنها تحمل المعلومات التنظيمية المركزية للجينات؛ ولذلك، وصف وشرح الصحيح أمر حيوي لفهم وظيفة الجينات. اعتماداً على أنماط التعبير، تصنف المروجين المصنع التأسيسي، والأنسجة على حدة، أو الخاصة بالتنمية-المرحلة وإيندوسيبلي1. أوجه التقدم في تكنولوجيات ترانسكريبتوميك وإدخال تحسينات على النمذجة الكمبيوتر وتوفر إعداد متزايدة من تسلسل الجينوم للأنواع النباتية المختلفة قد يسرت التنبؤ على نطاق واسع بتسلسل المروج2.
من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. خلافا لغيرها من النباتات النموذجية، تعوق توصيف الوظيفية الشائعة الفول البقول (P. الشائع) الجينات أساسا نظراً لطبيعة المعاندة sp. فاصولياء للتحول الوراثي مستقرة. نظم التحويل عابر كبديل للجينات السريع دراسات التوصيف الوظيفي3. في البقول التكافل بين البحث والتفاعل بين النبات المضيف البقوليات وبكتيريا رهيزوبيال أحد أنظمة نموذجية جانب آخر للتحليل الوظيفي الجينات الخاصة بالعقيدات ودراسات المروج. تتميز حتى الآن، كانت المروجين البقول عدة تتصل بهذه متنافسة، أي، PT4 فصة برميلية 4، SWEET115، العملاق japonicus لوتس ، أوبق6،7من VAG1، PT5 ماكس جليكاين 8Exo70J9ربوهب الشائع ص 10،،من1112، TRE113، PI3K14، تور15،، إلخ. رابطة الدول المستقلة عناصر تنظيم الجينات تؤثر بصورة مباشرة. عامل النسخ ENBP1A بربط منطقة كومنولث الدول المستقلة تنظيمية (−692 bp) من أوائل نودولين فودافونENOD12، وهذا يسهل التعبير عن الجين المراسل في العقيدات primordia فول بيقية16. الاستعاضة عن المناطق التنظيمية المستقلة (−161 إلى −48 bp) من المروج الخاصة بالعقيدات ليغيموجلوبين GLB3 مع مغايرة اقتطاع المروجين δ-p35S و δ-بنوس وأدت إلى فقدان خصوصية العقيدات وانخفاض نشاط المروج17 .
وتظهر التقارير السابقة أن عامل النسخ نين مطلوب لبدء الإصابة رهيزوبيال في خلايا جذور الشعر وضروري أيضا للعقيدات organogenesis في japonicus ل18. في الدراسة الحالية، ويصف لنا بروتوكول تحديد هوية والعزلة، والاستنساخ، وتوصيف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة. لتحقيق هذا الهدف، علينا تحديد rhizobial مروج نين خاصة بتكافل من الشائع P. والمستنسخة في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر رهيزوجينيس أ التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر في أقل من أسبوعين بعد التحول. وأخيراً، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في العقيدات الجذرية رهيزوبيا المستعمر تلطيخ غوس.
قد يكون من المفيد ليس فقط لدراسة نودولاتيون وميكورهيزاتيون11 من نباتات البقول، ولكن أيضا لدراسة أنماط التعبير المروج في جذور19الإجراء الموضح هنا. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء التحليل الوظيفي للجينات، دراسة أنماط التعبير الجيني يلعب دوراً حاسما في فهم التنظيم المكاني والزماني للجينات في الجسم الحي. طريقة معروفة لدراسة أنماط التعبير الجيني لاستنساخ منطقة المروج الجين موضع الاهتمام، المنبع لمراسل الجينات مثل الجينات علامة نيون (التجارة والنقل، وطلب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل جزئيا ديل المديرية العامة للشؤون التاريخ الشخصي، دجابا/بابيت-جامعة المكسيك الوطنية المستقلة (منحة لا. IN219916 M.L و IA205117 إلى م-ك. A) و y Consejo ناسيونال دي العلوم Tecnològia (منحة المجلس الوطني رقم 240614 لحركة التحرير).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
Riferimenti
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5′-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
