Análisis de expresión del promotor son cruciales para mejorar la comprensión de la regulación de los genes y la expresión espacio-temporal de genes diana. Adjunto presentamos un protocolo para identificar, aislar y clonar un promotor de la planta. Además, se describe la caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común.
Las aguas arriba secuencias de codificación de secuencias del gene se llaman como secuencias de promotor. Estudiar los patrones de expresión de los promotores son muy importantes en la comprensión de la regulación génica y patrones espacio-temporales de expresión de genes diana. Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. En este estudio, investigamos el patrón spatiotemporal de la expresión del promotor de creación (NIN) nódulo específico de simbiosis rizobios de Phaseolus vulgaris en las raíces pilosas transgénicos. Utilizando bases de datos de genoma vegetal y herramientas de análisis se identificaron, aislado y clonado el promotor NIN de p. vulgaris en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP de β-glucuronidasa (GUS). Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética en p. vulgaris usando Agrobacterium rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas de ≥ 2 cm en 10 a 12 días después de la transformación. A continuación, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en las raíces pilosas Rhizobium inoculados a intervalos periódicos de post-inoculación. Nuestros resultados descritas la actividad de GUS muestran que el promotor de NIN fue activado durante el proceso de nodulación. Juntos, el presente Protocolo muestra cómo identificar, aislar, clonar y caracterizar un promotor de la planta en las raíces pilosas de frijol común. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.
Promotores son herramientas biológicas moleculares importantes que desempeñan un papel crucial en la comprensión de la regulación de la expresión de genes de interés. Promotores son secuencias de ADN ubicadas aguas arriba de la traducción codón de la iniciación del gene de secuencias y llevan la información reguladora central de genes; por lo tanto, su correcta anotación y caracterización son vitales para entender la función del gene. Dependiendo de los patrones de expresión, promotores de la planta se clasifican como constitutivos, específicos de tejido, o específicos de etapa de desarrollo y inducible1. Avances en tecnologías transcriptómicos, mejoras en el modelado de la computadora y la disponibilidad de un número creciente de secuencias del genoma de diferentes especies de plantas han facilitado la predicción a gran escala de promotor secuencias2.
Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. A diferencia de las otras plantas del modelo, la caracterización funcional de genes de leguminosa (p. vulgaris) frijol común es impedida principalmente debido a la naturaleza recalcitrante de Phaseolus SP. para la transformación genética estable. Transformación transitoria sistemas sirven como una alternativa para la caracterización funcional de genes rápida estudios3. En la investigación de la simbiosis de leguminosas, la interacción entre la planta huésped de leguminosas y rizobios bacteria es uno de los sistemas modelo más manejables para el análisis funcional de genes específicos de nódulo y promotor estudios. Caracterizado hasta el momento, han sido varios promotores de leguminosas relacionadas con estas simbiosis, viz, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, glicina max PT5 8, Exo70J9, p. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etcetera. CIS elementos influyen directamente en Regulación génica. El factor de transcripción ENBP1A se une a una región reguladora de Cis (−692 bp) de nodC temprana ENOD12 Vf, y esto facilita la expresión de un gen reportero en primordios de nódulo de Vicia faba16. Reemplazo de regiones reguladoras Cis (−161 para −48 bp) del promotor específico de nódulo melocotonero GLB3 con la heteróloga truncado promotores δ-p35S y δ-pNOS, resultó en una pérdida de especificidad del nódulo y disminución de la actividad de promotor17 .
Informes anteriores indican que el factor de transcripción NIN es necesario para el inicio de la infección por rizobios en las células de pelo de la raíz y también es esencial para la organogénesis del nódulo en L. japonicus18. En el presente estudio, se describe un protocolo para la identificación, aislamiento, clonación y caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común. Para lograr esto, seleccionamos promotora rizobios del NIN de simbiosis específica de p. vulgaris y reproducido en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP. Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética de p. vulgaris con a. rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas en menos de 2 semanas después de la transformación. Finalmente, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en nódulos radiculares de rizobios colonizados por tinción GUS.
El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación y micorrización11 de plantas leguminosas, sino también para el estudio de patrones de expresión del promotor en raíces19. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.
Durante el análisis funcional de genes, el estudio de patrones de expresión genética desempeña un papel crucial en la comprensión de la regulación espacial y temporal de los genes en vivo. Es un método bien conocido para estudiar patrones de expresión del gen a clonar la región del promotor del gen de interés, río arriba a genes del reportero como genes marcador fluorescente (GFP, RFP, etc.) o β-glucuronidasa. En este documento, hemos seleccionado una región del promotor de la raíz nódulo…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue parcialmente financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (no de la concesión. IN219916 M.L y IA205117 a M-K. A) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (beca CONACYT no. 240614 a M.L.).
Primers for qRT-PCR assay | |||
pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT | |||
Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |