Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado
Summary
Aquí presentamos una adaptación de la pasivo claridad y método de la reconstrucción 3D para la visualización de la vasculatura ovárica y foliculares capilares en ovarios de ratón intacto.
Abstract
El ovario es el órgano principal del sistema reproductivo femenino y es esencial para la producción de gametos femeninos y para el control del sistema endocrino, pero las complejas relaciones estructurales y las arquitecturas de la vasculatura (3D) tridimensional de la ovario no están bien descritas. Para poder visualizar las conexiones de 3D y arquitectura de los vasos sanguíneos en el ovario intacto, el primer paso importante es hacer que el ovario ópticamente claro. Para evitar la contracción del tejido, se utilizó el hidrogel pasiva basada en la fijación de la claridad (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido imágenes / Immunostaining/In situ hibridación-compatible con tejido Hydrogel) protocolo método para borrar un ovario intacto . Immunostaining, microscopía confocal multifotón avanzada y reconstrucciones 3D de imagen entonces fueron utilizadas para la visualización de los vasos ováricos y tubos capilares foliculares. Usando este acercamiento, hemos demostrado una correlación positiva significativa (P < 0,01) entre la duración de la foliculares capilares y el volumen de la pared folicular.
Introduction
El folículo es la unidad fundamental estructural y funcional del ovario, y su desarrollo está muy relacionado con la vasculatura dentro del ovario. Los vasos sanguíneos suministrar nutrición y hormonas a los folículos y así desempeñar un papel importante en el crecimiento y maduración de los folículos1.
Una combinación de tecnologías, incluyendo marcadores selectivos vasculares, modelos de ratón transgénico y desarrollo farmacéutico, han aumentado nuestro conocimiento sobre redes vasculares ováricas, angiogénesis y la función de los vasos sanguíneos folliculogenesis. El ovario se conoce como un órgano activo porque remodela varias redes vasculares y tejidos durante la Foliculogénesis y la ovulación. Dicha remodelación activa en el tamaño y la estructura de los vasos es necesaria para la función biológica de desarrollo y reclutamiento de los folículos.
Los métodos histológicos e histomorfométricos tradicionales usando secciones ováricas y la inmunomarcación de los vasos sanguíneos se limitan a imágenes bidimensionales (2D)2. Con el desarrollo de las tecnologías de reconstrucción tridimensional (3D), se pueden superponer imágenes 2D de rebanadas de tejido para hacer una estructura 3D, pero esta modalidad todavía tiene algunas limitaciones, seccionamiento del tejido puede destruir las microestructuras, algunas partes de la tejido faltan a menudo, y trabajo importante está involucrado en hacer reconstrucciones 3D de imágenes de rebanadas. Conjunto tisular 3D con microscopia confocal puede superar muchas de estas limitaciones, pero estos métodos se limitan a la evaluación de la angiogénesis en el ovario embrionario3. Utilizando tejido entero claro métodos tales como la claridad4 puede aumentar el volumen visualizado con el fin de resolver estos problemas en los ovarios postnatales y adulto, y tales métodos proporcionan separación óptica del ovario sin deformaciones estructurales. La proyección de imagen de la arquitectura 3D de ovario intacto proporciona una base de datos de imagen precisa para software de análisis de imagen, como el paquete de software Imaris utilizado en este trabajo.
Remodelación del ovario a lo largo de la edad adulta es parte de un sistema dinámico de fisiológico, y esto hace que el ovario un excelente modelo para investigaciones sobre la regulación de la angiogénesis. Además, evaluar el papel de los vasos ováricos en condiciones patológicas del sistema reproductor femenino como el síndrome de ovario poliquístico o cáncer de ovario puede ser estudiada a través de la proyección de imagen de tejido ovárico todo. El desarrollo del método pasivo de claridad y el uso de software de análisis avanzado de imágenes han proporcionado información espacial detallada sobre las relaciones entre los vasos sanguíneos y estructuras ováricas tales como folículos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente estudio, presentamos proyección de imagen para evaluar las relaciones entre los capilares y los folículos en crecimiento individuales 3D. En nuestro trabajo anterior utilizando el mismo protocolo 9, estudiamos las funciones de la vasculatura grandes, las interacciones entre los folículos y la ubicación de los folículos en ovarios de ratón intacto. El enfoque pasivo de la claridad nos permitió estudiar micro y macro vasculatures, folliculogenesis y las interrelaciones entre lo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones del fondo especial de China para posdoctorados (Nº 2014T70392 a YF), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81673766 a YF), el nuevo profesor cebado de fondo, la Fundación Zuoxue de la Universidad Fudan y el desarrollo Proyecto de medicina integradora de disciplinas Shanghai pico (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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