流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究
Summary
神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP) の式を駆動するという幹細胞分化記者に基づいています。
Abstract
膠芽腫 (GBM) は、成人では、米国だけで毎年約 14,000 人が死亡を引き起こす最も一般的なと最も致命的な原発性脳腫瘍です。診断後生存期間の中央値は、最大の外科的切除、放射線とテモゾロマイド化学療法と 15 ヶ月未満です。糸球体基底膜のより効果的な治療の開発に固有の課題がますます明らかになり、その不屈の侵襲性、標準治療への抵抗、遺伝的複雑性と分子適応性、および糸球体基底膜のサブポピュレーションを含む正常幹細胞に表現型の類似性を持つ細胞以下神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) といいます。GSCs は腫瘍の増殖・進展に必須なので、分化基づかせていた療法はこれらの難治性の腫瘍のための実行可能な治療法を表します。
次のプロトコルは、高スループット スクリーニング ・ GSC グリア分化を促進する小さい分子の同定を目的としたプラットフォームを確立する手順のコレクションを記述します。システムのコアではグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) 分化記者-構成要素です。プロトコルには、次の一般的な手順が含まれています: (1) GSC 分化記者ライン; の確立(2) テスト/検証記者 GSC 自己更新/クローン形成能力との関連性(3) の大容量フローサイトメトリーによる薬剤のスクリーニング。
スクリーニング プラットフォームは、GSCs の分化を促進する小さい分子を識別するために簡単かつ安価な方法を提供します。さらに、FDA 承認薬の図書館の利用はより急速に再利用することができますエージェントの識別の可能性を保持しています。また、癌幹細胞の分化を促進する治療法は、ターゲットし、主により分化したがん細胞を排除している現在の「ケアの標準」治療と相乗的働くと予想されます。
Introduction
最近の研究は、腫瘍が小さい人口を含む示されているがん幹細胞 (CSCs) または腫瘍幹細胞と呼ばれる細胞の腫瘍の進行、転移、化学療法やラジオ療法1,への抵抗に責任があります。2。 癌幹細胞と腫瘍内の区別された後代の存在性の促進の重要な要因である、従って癌3の治療の主要なハードルを表します。癌幹細胞理論によって提供される腫瘍細胞階層は、 4癌を治療するために新たな戦略の開発を触発しています。癌幹細胞をターゲットに 1 つのアプローチは、識別し、影響を受ける臓器の萌芽期の開発中に必要なことがわかっているシグナル伝達経路を阻害します。確かに、私たちと他の人まで神経幹細胞に関連するシグナル伝達経路ソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグとノッチ膠芽腫5,6,7での継続的な要件を説明する複数のペーパーを発行しています。この作品はいくつか糸球体基底膜の臨床試験のための理論的根拠を確固たるものにしました。癌幹細胞をターゲットに 2 番目のアプローチは、分化を促進するためです。このアプローチは、レチノイン酸 (ATRA、ビタミン A アナログ) と急性前骨髄球性白血病の治療に臨床および臨床研究から多くの良好な結果のためのサポートを受けています。ここで ATRA が成熟のブロックを削除し、8がん細胞の分化を促進する見つかりました。もっと最近、Piccirillo と同僚エレガントな示されている BMP 4 が GSC 重要な抗 GBM の効果生体外でそして生体内9アストロ サイト分化を促進すること。
現在の研究のための理論的根拠は、GSCs をターゲットに「逆工学」アプローチに基づいています。広大な不均一性癌の特徴の一つである貧困層の分化と糸球体基底膜の存在を考えるとかどうか、我々 はより有利な表現型 – アストロ サイトのような状態への分化を促進できると聞きました。ここでは、指定された腫瘍標本の GSCs を維持するが、むしろ所望の表現型 (例えば GFAP 陽性) の実現を目指し信号経路の事前の知識がありません。
このレポートでは、行を確立 GSC 分化記者-GSC 濃縮文化の伝達から GSC 栄養系選抜するための手順について説明します。使用される膠芽腫 neurosphere ラインは病院サンラッファ – ミラノ、イタリアで膠芽腫の診断で患者から教授アンジェロ Vescovi の研究所で確立されました。これらの行が盛んでいくつか出版物6,10、11,12,13,14。研究室では、これらのテクニックを実装することに興味がある人がレポーター検討していく細胞のがん幹細胞自己複製能力との関連性を決定することを強くお勧めします (これは任意の記者にも当てはまります)。フィールドで受け入れの in vitroクローンのアッセイのための詳しいプロトコルは、この15,16を達成するために提供しています。最後に、最後にフローサイトメトリーによる薬剤スクリーンの分化記者ラインの利用を記述する詳細なプロトコルが提供されます。注記のうち、同様にグリア分化のシステムが、ここで説明するが正常に設立し、GSC 記者行 MAP2:GFP (神経分化) 報道記者の統合を検証します。したがって、方法論は、この記述する紙、様々 な細胞に細胞分化の研究に適用できます。
いくつかの報告ではこの数字は最近の出版物で見つけることができます:”アトラクリウムベシル酸注射アンプルやその他の神経筋遮断剤グリア分化を促進し、神経膠芽腫幹細胞18を使い果たします。
Protocol
Representative Results
Discussion
それらを定義するマーカーに主に焦点を当てた GSCs の以前の研究のほとんどは、この研究しました逆のアプローチを取ること。GSCs (例えば、グリアと神経細胞のマーカーを発現する細胞) によって生成される差別化された後代に主に着目します。高スループットの細胞を用いた薬剤のスクリーニングの GFP の人間の GFAP プロモーター依存表現に基づくシステムの使用率を示します。すべての実…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH の R01CA187780 で部分的にサポートされています。
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
Riferimenti
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