סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה
Summary
פרוטוקול הקרנה יעילים מוצג לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים astroglial התמיינות בתאי גזע glioblastoma (GSCs). וזמינותו מבוסס על עיתונאי התמיינות תאי גזע לפיה הביטוי GFP משופרת (eGFP) הוא מונע על ידי האמרגן GFAP האנושית.
Abstract
גליובלסטומה (GBM) הוא הגידול במוח העיקרי הנפוץ ביותר וקטלני ביותר אצל מבוגרים, גורם בערך 14,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית לבדה. חציון ההישרדות לאחר אבחון הוא פחות מ-15 חודשים עם כימותרפיה כריתה, קרינה, temozolomide כירורגית מקסימלי. האתגרים הכרוכים בפיתוח טיפולים יעילים יותר GBM הפכו ליותר ויותר ברורה, כולל invasiveness הלא מתפשר שלו, עמידותו טיפולים סטנדרטיים, שלה המורכבות הגנטית הסתגלות מולקולרית ואת subpopulations של GBM תאים עם דמיון פנוטיפי לתאי גזע נורמלי, במסמך זה מתייחסים כאל תאי גזע glioblastoma (GSCs). בגלל GSCs נדרש עבור התקדמות וצמיחה של גידול, טיפול המבוסס על בידול מייצג של קיימא לטיפול אפנות עבור אלה neoplasms חשוכת מרפא.
הפרוטוקול הבא מתאר אוסף של הליכים להקים על תפוקה גבוהה הקרנת פלטפורמה מכוון הזיהוי של מולקולות קטנות המקדמים GSC astroglial בידול. הליבה של המערכת הוא חלבון חומצי fibrillary (GFAP) גליה הבידול כתב-בונה. הפרוטוקול מכיל כללי ההליכים הבאים: (1) הקמת קווי הכתב של בידול GSC; (2) בדיקה/אימות הרלוונטיות של הכתב קיבולת העצמי-חידוש/clonogenic GSC; (3) קיבולת גבוהה cytometry זרימה מבוסס והתרופות הקרנה.
פלטפורמת ההקרנה מספקת גישה פשוטה וזולה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמים GSCs בידול. יתר על כן, ניצול של ספריות של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA מחזיק את פוטנציאל הזיהוי של סוכנים ניתן יהיה לשנות את ייעודו במהירות רבה יותר. כמו כן, טיפולים המקדמים התמיינות תאי סרטן צפויים לפעול בסינרגיה עם טיפולים שוטפים “סטנדרט של טיפול”, אשר הוכחו היעד ולחסל התאים הסרטניים הבדיל יותר בעיקר.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גידולים מכילים אוכלוסיה קטנה של תאים, כינה את תאי הגזע הסרטניים (CSCs) או ייזום-גידול תאים, אשר אחראים על התקדמות הגידול, גרורות, עמידות בפני כימותרפיה-רדיו-טיפולים אלטרנטיביים 1, 2. הנוכחות של תאי הגזע הסרטניים, שלהם progenies הבדיל יותר בתוך גידולים נחשב גורם חשוב בקידום intratumoral הטרוגניות, ובכך מייצג משוכה גדולה בטיפול סרטן3. גידול תאים היררכיה, שמספקת התיאוריה תאי סרטן, נתן השראה לפיתוח אסטרטגיות חדשות לטיפול סרטן 4. גישה אחת הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לזהות ומעכבות איתות המסלולים הידועים להידרש במהלך התפתחות של האיבר המושפע. אכן, אנחנו ואחרים בעבר פרסמו מסמכים מרובים המתארת את הדרישה מתמשך תאי גזע-רלוונטי איתות מסלולים עצביים סוניק הקיפוד, דרגה ב גליובלסטומה5,6,7. עבודה זו סייעה תוך שהשרף מתהווה הרציונל מספר ניסויים קליניים GBM. הגישה השניה הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לקדם את הבידול שלהם. גישה זו קיבלה הרבה תמיכה בשל תוצאות חיוביות קליניים וקליניים בטיפול לוקמיה פרומיאלוציטית חריפה עם חומצות retinoic (ATRA, אנלוגי של ויטמין A). כאן ATRA נמצאה כדי להסיר את החסימה ההבשלה ולקדם סרטן התא בידול8. לאחרונה, Piccirillo ועמיתיו באלגנטיות הראו כי BMP-4 מקדמת GSC בידול לתוך האסטרוציטים משמעותית אנטי-GBM אפקטים במבחנה , ויוו9.
הרציונל שבבסיס המחקר הנוכחי מבוסס על גישה “הנדסה הפוכה” עבור מיקוד GSCs. בהתחשב את הטרוגניות עצום נוכח ב- GBM, עם בידול המסכן של גולת הכותרת של סרטן, שאלנו אם אנחנו יכולים לקדם את הפנוטיפ למענך – בידול לתוך מצב דמוי אסטרוציט. כאן, אין לנו ידיעה מוקדמת מסלולים איתות לשמור על GSCs הדגימה גידול נתון אך מעדיף מכוונים להשיג הפנוטיפ הרצוי (למשל GFAP חיוביות).
הדו ח מתאר את ההליכים המשמשים ליצירת GSC בידול כתב-קווים מן התמרה חושית של תרבויות מועשר-GSC GSC שבטים. הקווים neurosphere גליובלסטומה המשמשים הוקמו במעבדה של פרופסור אנג’לו Vescovi של חולים עם אבחנה של גליובלסטומה ראשי בבית החולים סן רפאלה – מילאנו, איטליה. קווים אלה נחקרו בהרחבה מספר פרסומים 6,10,11,12,13,14. מומלץ מאוד כי אנשים המעוניינים ביישום טכניקות אלה במעבדה שלהם לקבוע את הרלוונטיות של הכתב קיבולת התחדשות עצמית תאי סרטן בתאים הם מתכננים ללמוד (זה נכון גם לגבי שום כתב). פרוטוקול מפורט לאחד במבחנה clonogenic מבחני מקובלים בתחום מסופק כדי להשיג את זה15,16. לבסוף, פרוטוקול מפורט המתאר את הניצול של בידול הכתב-בשורות מסך סמים מבוסס cytometry זרימה מסופק בסוף. ראוי לציין, באופן דומה למערכת בידול astroglial המתוארים כאן, יש לנו בהצלחה הוקמה ואנו לאמת GSC כתב שורות שילוב של הכתב (בידול עצביים) MAP2:GFP. לכן, למתודולוגיות לתאר זה נייר ניתן להחיל ללמוד התמיינות לתוך שושלות תאים שונים.
כמה מן הדמויות בדו”ח זה ניתן למצוא בפרסום האחרונים:”Atracurium Besylate סוכנים אחרים חסימת עצב-שריר לקדם astroglial בידול, לרוקן glioblastoma תאי גזע18.
Protocol
Representative Results
Discussion
ואילו רוב המחקרים הקודמים של GSCs התמקדה בעיקר סמני שמגדירים אותם, במחקר זה החלטנו לנקוט בגישה הפוכה. אנו מתמקדים בעיקר progenies הבדיל שנוצר על ידי GSCs (למשל, תאים לבטא astroglial סמנים עצביים). כאן אנחנו מדגימים את הניצול של תרופה מבוססת תא תפוקה גבוהה מערכת, אשר מבוססת על הביטוי תלוי-יזם GFAP האנושי GFP ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו חלקית בתמיכתם NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
Riferimenti
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
