Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern
Summary
Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.
Abstract
Glioblastom (GBM) ist die häufigste und tödlichste primäre Gehirntumor bei Erwachsenen verursacht rund 14.000 Todesfälle pro Jahr allein in den USA. Mediane Überlebenszeit nach Diagnosestellung beträgt weniger als 15 Monate mit maximalen chirurgische Resektion, Strahlung und Temozolomid Chemotherapie. Die Herausforderungen bei der Entwicklung effektiver GBM Behandlungen immer deutlicher geworden, und gehören seine unnachgiebige Invasivität, seiner Beständigkeit gegenüber standard-Behandlungen, seine genetische Komplexität und molekulare Anpassungsfähigkeit und Subpopulationen von GBM Zellen mit phänotypischen Ähnlichkeit zu normalen Stammzellen, hierin als Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) bezeichnet. Da die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen für Tumorwachstum und Progression erforderlich sind, stellt Therapie auf der Basis der Differenzierung eine praktikable Behandlungsmethode für diese unheilbaren Tumoren dar.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Auflistung von Verfahren, die einen hohen Durchsatz screening-Plattform zur Benennung von kleinen Molekülen, die Förderung der GSC Astroglial Differenzierung zu schaffen. Das Herzstück des Systems ist ein glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Differenzierung Reporter-Konstrukt. Das Protokoll enthält die folgenden allgemeinen Verfahren: (1) Festlegung GSC Differenzierung Reporter; (2) Prüfung/Validierung der Relevanz des Reporters GSC selbst-Erneuerung/klonogenen Kapazität; und (3) Hochleistungs-Durchflusszytometrie Drogen-Screening.
Die Screening-Plattform bietet einen einfache und kostengünstigen Ansatz um kleine Moleküle zu identifizieren, die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Differenzierung fördern. Darüber hinaus hält Nutzung der Bibliotheken der FDA-zugelassene Medikamente das Potenzial für die Identifizierung der Agents, die schneller verwendet werden können. Außerdem sollen Therapien, die Krebs-Stammzell-Differenzierung fördern synergistisch mit aktuellen “Pflege” Standardtherapien zu arbeiten, die gezeigt worden, um gezielt zu beseitigen in erster Linie mehr differenzierte Krebszellen.
Introduction
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Tumoren eine kleine Population enthalten von Zellen, die Krebs-Stammzellen (CSCs) oder Tumor-initiierenden Zellen bezeichnet sind verantwortlich für die Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemo – und Radio-Therapien 1, 2. das Vorhandensein von Krebs-Stammzellen und ihre differenzierten Stammarten in Tumoren gilt als einen wichtigen Faktor zur Förderung intratumorale Heterogenität und stellt somit eine große Hürde bei der Behandlung von Krebserkrankungen3. Tumor Zelle Hierarchie, bereitgestellt durch die Krebs-Stammzellen-Theorie hat die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebserkrankungen 4inspiriert. Ein Ansatz für die Zielgruppenadressierung Krebsstammzellen ist zu identifizieren und hemmen Signalwege, die bekanntermaßen während der embryonalen Entwicklung des betroffenen Organs erforderlich sind. In der Tat haben wir und andere zuvor mehrere Papiere, beschreibt die laufende Anforderung für die neuronale Stammzellen-relevanten Signalwege Sonic Hedgehog und Kerbe in Glioblastom5,6,7veröffentlicht. Diese Arbeit hat dazu beigetragen, die Verfestigung der Grund für mehrere GBM klinische Studien. Ein zweiter Ansatz für Krebs-Stammzellen-targeting ist ihre Differenzierung zu fördern. Dieser Ansatz hat eine Menge Unterstützung aufgrund der günstigen Ergebnisse von präklinischen und klinischen Studien bei der Behandlung von akuten Promyelocytic Leukämie mit Retinsäuren (ATRA, ein Vitamin-A-Analog) erhalten. Hier fand ATRA, entfernen die Reifung Block zu Krebs Zelle Differenzierung8. Piccirillo und Kollegen haben in jüngerer Zeit, elegant gezeigt, dass BMP-4 GSC Differenzierung in Astrozyten mit bedeutenden Anti-GBM-Effekte in Vitro und in Vivo9fördert.
Die Gründe für die vorliegende Studie basiert auf einer “Reverse Engineering” Ansatz für die Ausrichtung der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen. Angesichts die große Heterogenität in GBM und schlechte Differenzierung als eines der Markenzeichen von Krebs, fragten wir, ob wir einen günstigeren Phänotyp – Differenzierung in eine Astrozyten-artigen Zustand fördern könnten. Hier haben wir keine Vorkenntnisse in der Signalwege, die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen in einem bestimmten Tumor-Exemplar zu erhalten, sondern eher einen gewünschten Phänotyp (z.B. GFAP Positivität) erreichen wollen.
Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zum Herstellen von GSC Differenzierung Reporter-Linien von der Transduktion von GSC-angereicherten Kulturen zum GSC klonale Selektion verwendet. Die Glioblastom Neurosphäre Linien verwendet wurden im Labor von Professor Angelo Vescovi von Patienten mit der Diagnose einer primären Glioblastom am Krankenhaus San Raffaele – Mailand, Italien gegründet. Diese Zeilen wurden in mehreren Publikationen: 6,10,11,12,13,14ausgiebig untersucht. Es wird dringend empfohlen, dass Personen, die bei der Umsetzung dieser Techniken in ihrem Labor interessieren die Relevanz des Reporters zu Krebs Stammzell-Selbsterneuerung Kapazität in den Zellen bestimmen sie studieren möchten (Dies gilt für alle Reporter). Ein detailliertes Protokoll für eines der in-vitro- klonogenen-Assays im Bereich akzeptiert steht zur Verfügung, um diese15,16zu erreichen. Zu guter Letzt steht ein detailliertes Protokoll beschreibt die Nutzung der Differenzierung Reporter-Linien in einen Drogentest Durchflusszytometrie basiert am Ende zur Verfügung. Der Hinweis haben ähnlich zum Astroglial Differenzierung System hier beschrieben wird, wir erfolgreich etabliert und validiert GSC Reporter Linien einen MAP2:GFP (neuronale Differenzierung) Reporter zu integrieren. Daher beschreiben die Methoden in diesem Papier kann angewendet werden, um zellulare Unterscheidung in verschiedene Linien der Zelle zu studieren.
Einige der Zahlen in diesem Bericht finden Sie in einer kürzlich erschienenen Publikation: “Atracurium Besylate und anderen neuromuskulären Blockern Astroglial Differenzierung fördern und zum Abbau Glioblastom Stammzellen18.”_FITTED
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die meisten der bisherigen Studien der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Markierungen, die sie definieren, in dieser Studie haben wir beschlossen das umgekehrte Vorgehen. Wir konzentrieren uns in erster Linie auf die differenzierten Stammarten erzeugt durch die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen (z. B. Zellen, die mit dem Ausdruck Astroglial und neuronale Marker). Hier zeigen wir Ihnen die Nutzung von zellbasierten Hochdurchsatz-Drogen-screening-S…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R01CA187780 unterstützt.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
Riferimenti
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