Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen
Summary
Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.
Abstract
Antilichamen spelen een cruciale rol in de koppeling van de aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale pathogenen via hun antigeen-bindende domeinen en Fc-regio’s. Hier beschrijven we hoe meet je de activering van Fc effector functies door monoclonal antilichamen gericht op het influenza virus hemagglutinine met het gebruik van een genetisch gemanipuleerde Jurkat cellijn uitdrukken activeren van een type 1 Fc-FcγR. met behulp van deze methode, de bijdrage van specifieke Fc-FcγR interacties immunoglobulinen toekent, kan worden bepaald met behulp van een in vitro assay.
Introduction
Traditioneel is immuniteit geboden door de seizoensgebonden griepvaccin beoordeeld door de hemagglutination inhibitie (HI) assay1, die de aanwezigheid van antilichamen die gericht zijn op de receptor bindende site van het hemagglutinine meet. Deze antilichamen HI-actieve steriliserende immuniteit kunnen verlenen, maar zijn over het algemeen smal in hun breedte van bescherming, het verlenen van immuniteit aan slechts een select paar stammen van het influenzavirus. De isolatie en de karakterisering van de breed-reactieve monoclonal antilichamen die de hemagglutinine (HA herkent) stel voor dat de ontwikkeling van een universele griepvaccin ligt binnen handbereik2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. een van de belangrijkste doelen van een universele influenza vaccin is voor het opwekken van een sterke antistofrespons richting de geconserveerde gebieden van het influenza virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. in het algemeen reactief antilichamen die deze geconserveerde epitopes, samengesteld uit zowel neutraliseren en niet-neutraliserende antilichamen17,18 herkent, is aangetoond dat ze vereisen Fc-FcγR interacties voor optimale bescherming in vivo en markeer de bijdrage van Fc-gemedieerde immuniteit aan de algehele immune reactie op griep virus19,20.
Correlaten van bescherming zijn van cruciaal belang bij de beoordeling van immuniteit tegen infectie. Deze statistieken kunnen wetenschappers en clinici te schatten van de werkzaamheid van vaccins, de betekenis van de gegevens, en de cursus van behandeling. Het enige gevestigde correlaat van bescherming tegen besmetting van de griep-virus is de hemagglutination inhibitie-test. Een titer van 1:40 is geassocieerd met een vermindering van 50% in het risico van ziekte1,21 – en weerspiegelt de aanwezigheid van antilichamen die een remmende werking van agglutinatie richten op de receptor binden vindplaats op de bolvormige kop van de HA. Echter moet ook opgemerkt worden dat T-cel reacties een betere correlaat van bescherming tegen besmetting van het virus van de griep op de ouderen wellicht. Interessant, suggereert een recent rapport dat neuraminidase remming activiteit kan een betere voorspeller van immuniteit tegen influenza22. Gelukkig, typisch in vitro testen zoals neutralisatie of neuraminidase remming assays HA stengel – of neuraminidase-specifieke antilichamen kunnen meten. De meeste van deze conventionele in vitro tests, echter alleen rekening houden met de functie van de antigeen-bindende regio van het antilichaam en meten niet de rol van de Fc-regio. Daarnaast zijn de bijdrage van niet-neutraliserende antilichamen die via Fc receptor betrokkenheid in vivo beschermen niet gevonden17,18. Om te meten bescherming door antistoffen die Fc-gemedieerde immuniteit zoals antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC induceren), is een robuust in vitro -assay nodig.
De onderstaande methode beoordeelt de mogelijkheid van lymfkliertest monoclonal antilichamen voor het opwekken van Fc-gemedieerde functies met behulp van een genetisch gemodificeerde Jurkat cellijn uiting geven aan een activeren RattenUitrustingen Typ 1 FcR, FcγRIV. De betrokkenheid van het antilichaam van de FcγR transduces intracellulaire signalering die triggers nucleaire factor van geactiveerde T-cellen-gemedieerde luciferase activiteit. De bepaling heeft diverse voordelen ten opzichte van traditionele technieken waarvoor isolatie en cultuur van primaire effector cellen en het gebruik van stroom cytometry gedetecteerd activering van Fc-gemedieerde effector functies19,23,24 ,25,26. Ten eerste kan het protocol beschreven hier gemakkelijk worden aangepast aan het nemen verschillende virale doelen, FcγRs en antilichamen van verschillende soorten (METMENSELIJKE en lymfkliertest). Ten tweede, het gebruik van een gemodificeerde cel Jurkat lijn uiting geven aan een FcγR met een luciferase verslaggever gen onder een nucleaire factor van geactiveerde T-cel (NFAT) voorziet in een groot formaat assay die gemakkelijk kan worden geanalyseerd met behulp van een afleesapparaat meten van luminescentie. Hier wordt de traditionele activering van primaire effector cellen vervangen door de inductie van NFAT-luciferase op antilichaam betrokkenheid van een FcγR op het oppervlak van de Jurkat-cel. Deze bepaling van de indeling 96-wells-plaat zorgt voor de meting van maximaal vier verschillende monsters in triplicates met zeven verdunningen – een aantal monsters dat kan erg onhandig zijn om met behulp van traditionele technieken. Er zijn extra punten te overwegen met deze test die kan invloed hebben op het ontwerp van experimenten en de interpretatie van de gegevens. De virale doelstelling moet worden uitgedrukt op het celoppervlak om erkenning van het antilichaam. Om te verhelpen dit, kan het doel antigeen (bijvoorbeeld een interne virale eiwitten) direct worden bekleed op het oppervlak van een plaat. Echter is dit nog niet grondig getest. Bovendien, de gemodificeerde cellijn van Jurkat spreekt slechts één type FcγR activeren en doet niet express eventuele remmende FcγRs, terwijl de primaire cellijnen express alle receptoren in een fysiologische context.
We hebben eerder deze test gebruikt om aan te tonen dat epitoop specificiteit in een polyclonal context een cruciale rol speelt bij het reguleren van de Fc-gemedieerde effector functies en dat optimale activatie van antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde reactie twee punten van vereist Neem contact op met27,28. Hier beschrijven we een methode die het vermogen van de stengel-specifieke monoclonale antistoffen aan te gaan en het activeren van de RattenUitrustingen activeren FcγRIV beoordeelt. Hoewel er uitzonderingen29,30, een groot aantal grotendeels reactief antilichamen richten op de regio antigenisch geconserveerde stengel van het hemagglutinine en zo een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van een universele influenza vaccin.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode kan de gebruiker het vermogen meten van een HA-specifiek monoklonaal antilichaam aan de lymfkliertest FcγRIV. De doel-antigeen, influenza virus hemagglutinine, wordt uitgedrukt op het oppervlak van cellen na infectie door een virus of transfectie van plasmide DNA. De bepaling is verder vatbaar voor het gebruik van verschillende oppervlakte-uitgedrukt virale eiwitten in combinatie met andere FcγRs (mensen of RattenUitrustingen). Bovendien, wij zijn gewend sera monsters beoordelen het vermogen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd met de federale middelen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, onder CEIRS contract P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
Riferimenti
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942 (2008).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
- Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , (2014).
- Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
- Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
- Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95 (2016).
- Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
- Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
- Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).
- DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
- DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
- Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
- Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417 (2016).
- Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
- Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
- Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
- Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
- He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
- Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225 (2016).
- Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
- Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
- He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610 (2015).
- Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
- Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
- Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
- Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).
