Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe
Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour mesurer l’activation des fonctions effectrices Fc-médiée par les anticorps qui ciblent l’hémagglutinine du virus influenza. Ce test peut également être adapté afin d’évaluer la capacité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sérums ciblant d’autres glycoprotéines de surface virales à provoquer l’immunité induite par le Fc.
Abstract
Les anticorps jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée et adaptative contre des pathogènes viraux par le biais de leurs domaines de liaison de l’antigène et Fc-régions de couplage. Ici, nous décrivons comment mesurer l’activation du Fc fonctions effectrices par anticorps monoclonal ciblant l’hémagglutinine de virus de la grippe à l’aide d’une lignée de cellules Jurkat génétiquement modifiée exprimant une activation de type Fc 1-FcγR. à l’aide de cette méthode, la contribution des interactions spécifiques de Fc-FcγR conférés par immunoglobulines peut être déterminée à l’aide d’un test in vitro .
Introduction
L’immunité prévue par le vaccin contre la grippe saisonnière a traditionnellement été évaluée par l’hemagglutination inhibition (HI) test1, qui mesure la présence d’anticorps qui ciblent le site de liaison du récepteur de l’hémagglutinine. Ces anticorps HI-active peuvent conférer une immunité stérilisante, mais sont généralement étroites dans leur largeur de protection, en accordant l’immunité à seulement un peu select souches du virus grippal. L’isolement et la caractérisation d’anticorps monoclonaux largement qui reconnaissent l’hémagglutinine (HA) suggèrent que le développement d’un vaccin antigrippal universel est à portée de main2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. l’un des objectifs majeurs d’un vaccin antigrippal universel est d’induire une réponse anticorps forte vers les régions conservées de la grippe virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. globalement réactifs anticorps qui reconnaissent ces épitopes conservés, composé de neutralisants et non neutralisants anticorps17,18, auraient dû être divulgués d’exiger des interactions Fc-FcγR pour optimal protection in vivo et mettre en évidence la contribution de l’immunité à médiation Fc à l’immuno-réaction globale à l’influenza virus19,20.
Corrélats de protection sont essentiels dans l’évaluation de l’immunité aux infections. Ces mesures permettent des scientifiques et cliniciens estimer l’efficacité des vaccins, l’importance des données et la durée du traitement. Le seul corrélat établi de protection contre l’infection par le virus grippal est essai d’inhibition de l’hémagglutination. Un titre de 01:40 est associé à une réduction de 50 % du risque de maladie1,21 – et reflète la présence d’anticorps inhibant l’agglutination en ciblant le récepteur liaison site situé sur la tête globulaire de l’AP. Toutefois, il convient également de noter que les lymphocytes-T peuvent être un meilleur corrélat de protection contre l’infection par le virus de grippe chez les personnes âgées. Fait intéressant, un récent rapport suggère que l’inhibition de l’activité neuraminidase peut-être être un meilleur prédicteur de l’immunité grippe22. Heureusement, typique en vitro tests comme les tests d’inhibition de neutralisation ou de la neuraminidase peuvent mesurer les anticorps propres à tige ou neuraminidase HA. La plupart de ces dosages classiques en vitro , cependant, seulement prend en compte la fonction de la région de liaison de l’antigène de l’anticorps et ne mesure pas le rôle de la région Fc. En outre, la contribution des anticorps non neutralisants qui protègent via Fc récepteur engagement in vivo ne sont pas dépistés17,18. Afin de mesurer la protection conférée par les anticorps qui stimulent l’immunité à médiation Fc comme la cytotoxicité de cellule dépendante médiée par anticorps (ADCC), il faut un dosage fiable in vitro .
La méthode décrite ci-dessous évalue la capacité des anticorps monoclonaux murins pour induire des fonctions Fc-négociée par l’utilisation d’une lignée de cellules Jurkat transgénique exprimant une activation murin tapez 1 FcR, FcγRIV. Engagement d’anticorps de la FcγR transduit signalisation intracellulaire ce facteur nucléaire de déclencheurs de l’activité de la luciférase de médiée par les T-cellules activées. Le test a plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles qui nécessitent l’isolement et de culture de cellules effectrices primaires et de l’utilisation de la cytométrie pour détecter l’activation induite par le Fc effecteur fonctions19,23,24 ,25,26. Tout d’abord, le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour intégrer les différentes cibles virales, FcγRs et anticorps provenant de différentes espèces (humains et murins). Deuxièmement, l’utilisation d’une cellule modifiée de Jurkat ligne exprimant un FcγR avec un gène de rapporteur luciférase sous un facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) permet un dosage de grand format qui peut être facilement analysé à l’aide d’un lecteur de luminescence de mesure. Ici, la traditionnelle activation des cellules effectrices primaires est remplacée par l’induction de la luciférase-NFAT sur engagement des anticorps d’un FcγR sur la surface de la cellule Jurkat. Ce dosage de format de plaque à 96 puits permet la mesure de jusqu’à quatre différents échantillons en géométrie avec sept dilutions – un nombre d’échantillons pouvant être encombrant selon les techniques traditionnelles. Il y a des points supplémentaires à considérer pour cette analyse qui peut-être affecter la conception d’expériences et l’interprétation des données. La cible virale doit être exprimée à la surface cellulaire afin que la reconnaissance d’anticorps. Pour atténuer ce, l’antigène cible (par exemple une protéine virale interne) peut-être être directement enduit sur la surface d’une plaque. Toutefois, cela n’a pas encore été rigoureusement testé. En outre, la lignée Jurkat modifiée exprime qu’un seul type d’activation FcγR et n’exprime aucune inhibition FcγRs, tandis que les lignées cellulaires primaires expriment tous les récepteurs dans un contexte physiologique.
Nous avons déjà utilisé ce test pour démontrer que l’épitope spécificité dans un contexte polyclonaux joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions effectrices induite par le Fc et que l’activation optimale de la réponse à médiation cellulaire dépendante des anticorps requiert deux points de Contacter le27,28. Nous décrivons ici une méthode qui évalue la capacité des anticorps monoclonaux spécifiques à tige d’engager et d’activer le murin activation FcγRIV. Bien qu’il y a des exceptions29,30, un grand nombre d’anticorps largement cible la région de tige sur le plan antigénique conservée de l’hémagglutinine et joue ainsi un rôle important dans le développement d’une grippe universelle vaccin.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici permet de mesurer la capacité d’un anticorps monoclonal spécifique HA de pratiquer la FcγRIV murin. L’antigène cible, hémagglutinine de virus de la grippe, est exprimée à la surface des cellules après l’infection par le virus ou la transfection d’ADN plasmidique. L’essai est plus favorable à l’utilisation de différentes protéines virales exprimées à la surface en combinaison avec d’autres FcγRs (humains ou murin). En outre, nous avons utilisé des échantillons de sér…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé en partie avec des fonds fédéraux depuis le National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sous CEIRS contrat P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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