שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים
Summary
אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.
Abstract
נוגדנים לשחק תפקיד מכריע צימוד את תגובות מערכת החיסון מולדים, גמישים נגד פתוגנים ויראליים דרך שלהם אנטיגן מחייב תחומים ואזורים Fc. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את ההפעלה של Fc אפקטור פונקציות לפי פילוח של hemagglutinin וירוס שפעת עם השימוש של קו תא Jurkat מהונדס גנטית לבטא של הפעלת נוגדנים חד-שבטיים הקלד 1 Fc-FcγR-בשיטה זו, התרומה של אינטראקציות Fc-FcγR ספציפיים שהוענקו immunoglobulins יכול להיקבע תוך שימוש assay במבחנה .
Introduction
חסינות המסופקים על ידי חיסון שפעת עונתית באופן מסורתי העריכו את hemagglutination עיכוב (איץ ‘ אי) assay1, אשר מודד את נוכחותם של נוגדנים יעד האתר איגוד קולטן של hemagglutinin. נוגדנים אלה HI-פעיל יכול מעניקים חסינות לחיטוי, אך צרים בדרך כלל ב שלהם ולרוחבה של הגנה, מתן חסינות רק זנים נבחרים של וירוס שפעת. בידוד ואפיון של נוגדנים חד-שבטיים בהרחבה תגובתי מזהה את hemagglutinin (HA) מציע שהפיתוח של חיסון שפעת אוניברסלי נמצאת בהישג יד2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. אחת המטרות הגדולות של חיסון שפעת אוניברסלי היא כדי לגרום לתגובה חזקה נוגדן לכיוון האזורים שנשמרת שפעת וירוס9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. בהרחבה נוגדנים תגובתי מזהים אלה epitopes שנשמרת, המורכבת של נטרול והן הלא-נטרול נוגדנים17,18, הוכחו דורשים Fc-FcγR אינטראקציות של האופטימלית הגנה ויוו , המדגישות התרומה של חסינות בתיווך Fc התגובה החיסונית הכוללת שפעת וירוס19,20.
ה”מפה הגנה מכריעים בהערכת חסינות לזיהום. מדדים אלה מאפשרים רופאים ומדענים להעריך את היעילות של חיסונים, המשמעות של הנתונים, על מהלך הטיפול. לתאם הוקמה היחידה של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת היא וזמינותו עיכוב hemagglutination. כייל של 1:40 מזוהה עם הפחתה של 50% הסיכון של המחלה1,21 – ומשקף את הנוכחות של נוגדנים המעכבות התלכדות על ידי מיקוד את קולטן איגוד האתר ממוקם על ראש HA הכדוריים. עם זאת, גם יצוין כי תגובות תא T עשוי להיות עדיף לתאם של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת אצל הקשישים. מעניין, לאחרונה דו ח מצביע על כך neuraminidase עיכוב פעילות עשוי להיות מנבא טוב יותר של חסינות שפעת22. למרבה המזל, טיפוסי במבחנה מבחני כגון מבחני עיכוב ניטרול או neuraminidase יכול למדוד נוגדנים ספציפיים גבעול או neuraminidase HA. רוב אלה מבחני קונבנציונאלי במבחנה , עם זאת, רק לקחת בחשבון את הפונקציה של אזור איגוד אנטיגן הנוגדן ומדידת לא התפקיד של אזור Fc. בנוסף, התרומה של נוגדנים נטרול להגן באמצעות Fc קולטן האירוסין ויוו אינם שזוהו17,18. על מנת למדוד את ההגנה המוענקת על ידי נוגדנים זירוז בתיווך Fc חסינות כמו נוגדנים cytotoxicity מהתא מתווכת (ADCC), נדרשת assay חזקים במבחנה .
בשיטה המתוארת להלן מעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים מאתר לזירוז בתיווך Fc פונקציות באמצעות קו תא Jurkat מהונדסים לבטא של הפעלת הקלד מאתר ה-FcR 1, FcγRIV. נוגדן האירוסין של FcγR transduces הזה גורמים מפעילים גרעיני גורם לפעילות לוציפראז T תאים-בתיווך מופעל איתות תאיים. הבדיקה יש כמה יתרונות על פני שיטות מסורתיות הדורשים בידוד ואת התרבות של תאים אפקטור העיקרי ושימוש של cytometry זרימה כדי לזהות הפעלה של אפקטור בתיווך Fc פונקציות19,23,24 25, ,26. ראשית, הפרוטוקול המתואר כאן בקלות ניתן להתאים לשלב מטרות ויראליות שונות, FcγRs ונוגדנים ממינים שונים (מאתר ואנושי). שנית, השימוש תא Jurkat ששונה קו לבטא FcγR עם גנים כתב לוציפראז תחת מקדם הגרעין של תא T מופעל (NFAT) מאפשר assay בפורמט גדול מסוגל בקלות לנתח שימוש בקורא צלחת מדידה הפריה חוץ גופית. כאן, הפעלת המסורתי של תאים אפקטור העיקרי מוחלף על אינדוקציה של NFAT-לוציפראז על נוגדן האירוסין של FcγR על פני השטח של התא Jurkat. Assay תבנית זו צלחת 96-ובכן מאפשר המדידה של עד ארבע דוגמאות שונות triplicates עם שבע דילולים – מספר דוגמאות שיכול להיות מסורבלת בטכניקות מסורתיות. ישנן נקודות נוספות לשקול עם זה וזמינותו שעשויים להשפיע על העיצוב של ניסויים ופרשנות של נתונים. המטרה ויראלי חייב להתבטא על פני התא על מנת ל’זיהוי נוגדן. כדי להמתיק את זה, המטרה אנטיגן (למשל חלבון נגיפי פנימי) עשוי להיות ישירות מצופה על פני השטח של צלחת. עם זאת, זה לא עוד בקפדנות נבדקו. בנוסף, הקו תא Jurkat ששונה מבטא רק סוג אחד של הפעלת FcγR, ואינה מבטאת כל FcγRs מעכבות, ואילו התא הראשי קווי אקספרס קולטנים כל בהקשר פיזיולוגיים.
השתמשנו בעבר assay הזה כדי להדגים ירידה לפרטים epitope בהקשר polyclonal משחקת תפקיד חשוב בוויסות אפקטור בתיווך Fc פונקציות הפעלה מיטבית של תגובה תאית נוגדנים תלויי דורש שתי נקודות צור קשר עם27,28. כאן, אנו מתארים שיטה הבודק את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים גבעול ספציפית לעסוק ולהפעיל מאתר את הפעלת FcγRIV. למרות שיש חריגים29,30, מספר גדול של נוגדנים בהרחבה תגובתי למקד אזור גבעול שנשמרת antigenically hemagglutinin, וכך לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שפעת אוניברסלי חיסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשר למשתמש למדוד את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים HA ספציפית לעסוק FcγRIV מאתר. אנטיגן מטרה, hemagglutinin וירוס שפעת, מבוטא על פני השטח של התאים לאחר זיהום על-ידי וירוס או תרביות תאים של פלסמיד ה-DNA. וזמינותו היא עוד יותר נוטה באמצעות חלבונים ויראלי הביע משטח שונים בשילוב עם FcγRs אחר?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה יש כבר מומן בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מכוני הבריאות הלאומיים, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, תחת CEIRS חוזה P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
Riferimenti
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942 (2008).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
- Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , (2014).
- Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
- Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
- Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95 (2016).
- Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
- Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
- Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).
- DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
- DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
- Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
- Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417 (2016).
- Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
- Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
- Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
- Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
- He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
- Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225 (2016).
- Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
- Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
- He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610 (2015).
- Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
- Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
- Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
- Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).
