독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법
Summary
항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.
Abstract
항 체 항 원 바인딩 도메인 Fc 영역을 통해 바이러스 성 병원 체에 대 한 타고 난 및 적응형 면역 응답 커플링에 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리가 활성화를 측정 하는 방법에 설명 Fc의 단일 클론 항 체는 활성화 표현 유전자 조작된 Jurkat 세포 라인의 사용으로 인플루엔자 바이러스 조류를 대상으로 하 여 이펙터 기능 입력 1 Fc-FcγR. 전송 시각:이 메서드를 사용 합니다 특정 Fc-FcγR 상호 작용 면역 글로불린에 의해 수 여의 생체 외에서 분석 결과 사용 하 여 확인할 수 있습니다.
Introduction
계절 독감 백신에서 제공 하는 면역은 전통적으로 hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과1, 대상으로 하는 조류의 수용 체 바인딩 사이트 항 체의 존재를 측정 하 여 평가 되었습니다. 이러한이 활성 항 체 살 균 면역을 부여 수 있습니다 하지만 일반적으로 인플루엔자 바이러스의 단지 선택 몇 가지 계통에 면역을 제공 하는 보호의 그들의 범위에서 좁은. 격리 및 조류 (HA)를 인식 하는 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체의 특성화 제안 범용 인플루엔자 백신의 개발은 도달 시간2,,34, 5 , 6 , 7 , 8. 인플루엔자 바이러스9,10,,1112 의 보존된 지역으로 강한 항 체 응답을 유도 하는 것은 보편적인 인플루엔자 백신의 주요 목표 중 하나 , 13 , 14 , 15 , 16. 이러한 보존된 epitopes, 중화 및 비 중화 항 체17,18의 인식 반응 항 체 Fc-FcγR 상호 작용에 대 한 요구를 광범위 하 게 표시 되었습니다 최적의 vivo에서 보호 하 고 하이라이트 Fc 중재 면역 인플루엔자 바이러스19,20전반적인 면역 응답에의 기여.
보호의 관계가 중요 한 감염에 면역을 평가에 있습니다. 이러한 통계 과학자와 임상 백신의 효능, 데이터의 의미와 치료 과정을 추정 하실 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 유일한 설립된 상관 hemagglutination 저해 분석 결과 이다. 1시 40분의 titer 질병1,21 -위험 50% 감소와 관련 이며 바인딩 사이트는 HA의 구형 머리에 있는 수용 체를 대상으로 교착을 억제 하는 항 체의 존재를 반영 한다. 그러나, 그것은 또한 주목 해야한다 T 세포 응답 노인에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대 한 보호의 더 나은 상관 있을 수 있습니다. 흥미롭게도, 최근 보고서 응집 저해 행위 면책 독감22의 더 나은 예언자를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 다행히도, 일반적인 체 외에서 분석 실험 같은 중화 또는 응집 저해 분석 하 줄기 또는 응집 특정 항 체를 측정할 수 있습니다. 그러나 대부분 이러한 기존의 시험관에서 분석의,만 항 체의 항 원 바인딩 영역의 기능을 고려 하 고 Fc 영역의 역할을 측정 하지 않습니다. 또한, 비 중화 항 체 Fc 수용 체 참여에서 vivo에서 를 통해 보호 하는의 기여 감지17,18되지 않습니다. Fc 중재 면역 항 체 의존 세포 중재 세포 독성 (ADCC) 등을 유발 하는 항 체에 의해 여유 보호를 측정 하기 위하여 강력한 생체 외에서 시험이 필요 합니다.
아래 설명 하는 방법을 평가 수 murine 단일 클론 항 체의 Fc 중재 기능 활성화는 표현 유전자 변형된 Jurkat 세포 라인 사용 유도 murine 입력 1 FcR, FcγRIV. 항 체는 FcγR의 교전 세포내 신호 트리거 활성화 된 T 세포 중재 luciferase 활동의 핵 요인 transduces. 분석 결과 여러 장점이 격리 및 기본 효과 기 세포의 문화 및 cytometry Fc 중재 effector 기능19,23,24의 활성화를 감지를 사용 하 여 요구 하는 전통적인 기법 ,,2526. 첫째, 여기에 설명 된 프로토콜을 쉽게 통합 하는 다른 바이러스 성 대상, FcγRs, 및 다른 종 (인간과 murine)에서 항 체 적용할 수 있습니다. 둘째, 수정된 Jurkat 세포를 사용 하 여 표현 하는 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요인 아래 luciferase 취재 원 유전자와 FcγR 발광 측정 플레이트 리더를 사용 하 여 쉽게 분석할 수 있는 대형 분석 결과 대 한 수 선. 여기, 기본 효과 기 세포의 전통적인 활성화 Jurkat 세포의 표면에 FcγR의 항 체 참여 시 NFAT luciferase의 유도로 대체 됩니다. 이 96 잘 접시 형식 분석 결과 7 희석-성가신 전통적인 기술을 사용 하 여 될 수 있는 샘플 수와 triplicates에서 최대 4 개의 서로 다른 샘플의 측정에 대 한 수 있습니다. 이 분석 결과 실험의 설계 및 데이터의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다 고려해 야 할 추가 포인트가 있다. 바이러스 성 대상 항 체 인식에 세포 표면에 표현 해야 합니다. 이 줄이기 위해 대상 항 원 (예: 내부 바이러스 성 단백질)는 격판덮개의 표면에 직접 코팅 수 수 있습니다. 그러나, 이것은 아직 엄격 하 게 테스트 되지. 또한, 수정 된 Jurkat 세포 선 및 FcγR 활성화의 한 유형을 표현 1 차 셀 라인 표현 생리 적 맥락에서 모든 수용 체 어떤 금지 FcγRs을 표현 하지 않는다.
우리가 이전 polyclonal 컨텍스트에서 epitope 특이성 Fc 중재 effector 기능 조절에 중요 한 역할을 담당 하며 그 항 체-종속 셀 중재 응답의 최적 활성화의 두 가지 포인트를 설명 하기 위해이 분석 결과 사용 27,28문의. 여기, 우리가 참여 하 고 FcγRIV를 활성화 murine 활성화 줄기 특정 단일 클론 항 체의 능력을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 예외29,30비록 광범위 하 게 반응 항 체의 많은 수는 조류의 antigenically 보존된 스토킹 지역 대상 고 따라서 범용 인플루엔자의 개발에 중요 한 역 백신입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 메서드를 사용 하면 murine FcγRIV 참여 하 특정 단일 클론 항 체의 능력을 측정 하 수 있습니다. 대상 항 인플루엔자 바이러스 조류 바이러스 또는 플라스 미드 DNA의 transfection 감염 후 세포의 표면에 표현 된다. 분석 결과 (인간 또는 murine) 다른 FcγRs와 함께에서 다른 표면 표현 바이러스 성 단백질을 사용 하 여 의무가 더 이다. 또한, 우리는 세라 샘플 사용 Fc effector 기능 (데이터 표시 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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