Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Summary

I denne protokol, vi beskriver teknikker til ordentlig dissektion af Arabidopsis blomster og siliques, nogle grundlæggende clearing teknikker, og valgt Farvning procedurer for hele-mount observationer af reproduktive strukturer.

Abstract

På grund af dets formidable værktøjer til molekylær genetiske undersøgelser er Arabidopsis thaliana en af de mest fremtrædende model arter i plantebiologi og navnlig plante reproduktiv biologi. Dog inddrage plante morfologiske, anatomiske og ultrastrukturelle analyser traditionelt tidskrævende indlejring og skæring procedurer til lysfelt, scanning og elektronmikroskopi. De seneste fremskridt i Konfokal Fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3D-computer-aided mikroskopiske analyser og løbende forfinelse af molekylære teknikker skal anvendes på minimalt forarbejdede hele-mount prøver, har ført til øget efterspørgsel efter udvikle effektive og minimal prøve forarbejdningsteknik. I denne protokol, vi beskriver teknikker til korrekt dissekere Arabidopsis blomster og siliques, grundlæggende clearing-teknikker, og nogle farvning procedurer for hele-mount observationer af reproduktive strukturer.

Introduction

Blomster blandt de vigtigste definere organer af dækfrøede planter. Blomsterplanter dukkede op omkring 90-130 millioner år siden¹, og diversificeret så hurtigt, at deres hurtige udseende blev beskrevet som en “afskyelige mysterium” af Charles Darwin². Plante forskere interesser i blomst udvikling er forskellige. Nogle forskning har fokuseret på at forstå den evolutionære oprindelse af blomsten som helhed, eller udviklingen af særlige anatomiske, strukturelle og funktionelle egenskaber af blomster^3,4,5,6 . Den høje variation i blomstermotiver form og struktur, samt tilstande af kønnet og ukønnet reproduktion påberåbe dem, gøre blomsten en meget kompleks struktur. Dette har ført til forskellige bestræbelser på at karakterisere de anatomi og strukturelle elementer i blomstermotiver organer, ved hjælp af lys og elektron mikroskopiske teknikker, der kan kombineres med genetiske og molekylære undersøgelser⁷. Desuden, som kilde af frugter og frø, er blomster af afgørende betydning for menneskers og dyrs ernæring. Derfor, karakterisering af blomst og frugt udvikling har mange konsekvenser for anvendt forskning, herunder fødevaresikkerhed for en voksende befolkning og økologisk bevarelsesstrategier under et skiftende miljø^{8 , 9 , 10}.

Blomst udvikling i Arabidopsis starter med blomst induktion og omdannelsen af den vegetative meristem til en blomsterstand (gruppe af blomster) meristem. Blomst primordia initieres lateralt på flanken af blomsterstand meristem¹¹. Floral orgel primordia danne gradvis i koncentriske hvirvler udefra til midten af blomsten, og i sidste ende udvikle sig til bægerblade, kronblade, støvdragere og frugtblade⁷. Disse blomsteragtige organer opfylde særskilte nærende, beskyttende og funktionelle (fxbestøver tiltrækning) roller i forskellige plantearter, med kønsorganer fastholde udviklingen af mandlige og kvindelige gametofytter, henholdsvis^{12 , 13}. gametofytter, til gengæld hver skelne et par mand (sæd) og kvindelige kønsceller (æg og central celle), der forener på dobbelt befrugtning danner den næste generation, de befrugtede æg, og den primære frøhvide, en terminal væv støtte den udviklingen af fosteret^14,15. Frugt og frø udvikling støtter vækst, modning og opbevaring af embryoner og i sidste ende, dens spredning. Omfattende forskning er blevet udført for at karakterisere blomst og embryo udvikling i forskellige plantearter, især i arternes model Arabidopsis^7,16,17.

Tidlig mikroskopiske analyser af blomst udvikling var baseret på tidskrævende prøve behandling og observation teknikker, såsom paraffin eller harpiks indlejring og skæring, kombineret med lys eller Elektron Mikroskopi. Disse traditionelle mikroskopiske teknikker blev ofte brugt i kombination med molekylær genetiske undersøgelser, som mikroskopiske analyser af mutanter, lokalisering af RNA ved i situ hybridisering eller immuno-påvisning af proteiner. De seneste fremskridt i wide-felt og konfokal Fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3-D computer-aided billede analyser og løbende forfinelse af molekylære metoder, der kan bruges på minimalt forarbejdede hele-mount prøver, har ført til et behov for effektiv og minimal prøve databehandling, der er fortrinsvis indstillet til kvantitative analyser. I de seneste år, er der sket betydelige fremskridt i udviklingen af clearing teknikker på hele-mount animalske modellen. De render prøven gennemsigtig enten ved hjælp af vandig urea – eller sukker-baserede reagenser (fxSCALE, SeeDB, CUBIC)^18,19,20, eller ved selektivt at fjerne lipider (ved hjælp af vaskemiddel SDS) efter indlejring prøver i stabile hydrogels; fjernelse af lipider kan opnås enten ved passiv diffusion (f.eks.ændret klarhed protokol²¹, PAGTEN-PARS-fælge²²) eller aktivt ved elektroforese (oprindelige klarhed protokol²³ og ACT-PRESTO²⁴). Opmuntret af denne hurtige fremskridt, nogle afledte teknikker også vej til brug i planter.

I denne metoder papir fokuseret på model Arabidopsis, beskrive vi proceduren for ordentlig dissektion af blomsterknopper, blomster, og unge siliques og clearing af hele-mount prøver til forskellige farvning og observation procedurer ved hjælp af klassisk eller en nylig SDS-baserede clearing metode. Gives eksempler for stivelse, callose og kromatin farvning. Selvom disse procedurer kan have yderligere forbedringer og tilpasninger når det bruges med andre arter, håber vi, de vil sætte scenen for yderligere forskning på disse simple men kritiske metoder, der er udgangspunktet for mange forskningsprojekter.

Protocol

1. blomst og Silique fiksation Høst blomster og siliques fra planter synkroniseret ved åbningen af den første blomst.Bemærk: Under de eksperimentelle betingelser anvendes her, starte planter blomstringen ca 21 dage efter transplantation fra Murashige og Skoog (MS) plader til jord. Frø er stratificeret for 3-4 dage ved 4 ° C og spiret/dyrkes på MS plader på 22 ° C/16 h lys og 18 ° C/8 h mørke for 8-10 dage, før omplantning planter på næringsrig jord i potterne holdes under de samme betingelser …

Representative Results

Arabidopsis tilhører familien Brassicacea, forsynet med blomsterstande med biseksuelle blomster arrangeret i en halvskærm (figur 1). Hver blomst har fire bægerblade, fire kronblade, seks støvdragere (fire lange og to korte) og en en frugtstand Støvvejene er bestående af to medfødt sammenvoksede frugtblade (figur 1F-H) arrangeret i fire koncentriske hvirvler25,<su…

Discussion

Eksistensen af mange blomsterknopper inden for en enkelt blomsterstand af Arabidopsis, der spænder over alle blomst udviklingsstadier, tilbyder en unik mulighed for undersøgelser rettet mod kendetegner en effekt af en behandling eller en udviklingsmæssig funktion samtidigt på tværs af de forskellige stadier af blomst udvikling. En god referencepunkt mellem forskellige individuelle planter er åbningen af den første blomst af den største blomsterstand. Planter er behandlet på en sådan måde, at blomstrin…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.