Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

Summary

В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.

Abstract

Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.

Introduction

Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад¹и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина². Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы^3,4,5,6 . Высокая вариация в цветочные формы и структуры, а также виды сексуального и бесполого размножения, опираясь на них, сделать цветок очень сложную структуру. Это привело к разнообразные усилия для характеризуют анатомии и структурные особенности цветочные органов, используя свет и электрон микроскопические методы, которые можно было бы объединить с генетические и молекулярные исследования⁷. Кроме того, как источник плоды и семена Цветки имеют первостепенное значение для человека и животных питания. Таким образом характеристика развития цветка и плода имеет множество последствий для прикладных исследований, в том числе продовольственной безопасности растущего населения и сохранения экологических стратегий в рамках меняющейся окружающей среды^{8 , 9 , 10}.

Цветок развития в проростках Arabidopsis начинается с цветок индукции и преобразование вегетативного Меристемы на Меристемы соцветия (группа цветов). Цветок Примордия инициируются боково на фланге соцветия Меристемы¹¹. Примордия цветочные орган постепенно формируют концентрические мутовках от снаружи к центру цветка и в конечном итоге превратиться в⁷чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистиков. Эти цветочные органов выполнять собственный питательная, защитных и функциональных (например, привлечение опылителей) ролей в различных видов растений, с половыми органами, устойчивого развития мужских и женских gametophytes, соответственно^{12 , 13}. gametophytes, в свою очередь, каждый дифференцировать пару мужчин (спермы) и женские гаметы (яйца и центральная ячейка), которые объединяют по двойной оплодотворения в форме следующего поколения, зиготы и основной эндосперма, поддержка терминалов ткани развитие эмбриона^14,15. Плоды и семена развития поддержки роста, созревания и сохранение эмбриона и, в конечном счете, ее разгон. Обширные исследования была выполнена характеризовать цветок и развития эмбриона в видов различных растений, особенно в модели вида Arabidopsis^7,16,17.

Ранние микроскопические анализы цветок развития были основаны на времени пример обработки и наблюдения, что методы, такие как парафин или встраивание смолы и секционирование, в сочетании с легкими или электронной микроскопии. Эти традиционные микроскопические методы были часто используется в сочетании с молекулярные генетические исследования, такие как микроскопические анализы мутантов, локализация РНК путем в situ гибридизация или иммуно обнаружение белков. Недавний прогресс в-поля и конфокальный флуоресцентной микроскопии, в состояние искусства трехмерного компьютерного изображения анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов, которые могут быть использованы на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к необходимости методы обработки образца эффективной и минимальным, которые поддаются преференциально количественного анализа. В последние годы был достигнут значительный прогресс в развитии методов очистки на целом гора животных образца. Они транспарентности образца либо с помощью водного раствора мочевины – или на основе сахара реагенты (например, масштаб, SeeDB, КУБИЧЕСКИЙ)^18,19,20, или выборочно удалить липидов (с использованием моющего средства SDS) после Встраивание образцов в стабильных гидрогели; удаление липидов может быть достигнуто либо путем пассивной диффузии (например, изменение ЯСНОСТИ протокол²¹, Пакт-ПАРС-колеса²²) или активно электрофорезом (оригинал ЯСНОСТИ протокол²³ и акт-вуаля²⁴). Воодушевленные этой быстрый прогресс, некоторые производные методы появляются также для использования в растениях.

В этом документе методы сосредоточены на модели Arabidopsisмы описываем порядок надлежащего вскрытия бутонов, цветов, и молодые siliques и очистки всего гора образцов для разнообразной окраски и процедуры наблюдения с помощью Классическая или недавно метод очистки на базе ИКБ. Даны примеры крахмал, callose и окрашивание хроматина. Хотя эти процедуры может понадобиться дальнейшего улучшения и адаптации при использовании с другими видами, мы надеемся, что они будут почву для дальнейших исследований на этих простых, но важных методов, которые являются отправной точкой многих научно-исследовательских проектов.

Protocol

1. цветок и стручок фиксации На открытии первого цветка синхронизации урожай цветы и siliques из растений.Примечание: В экспериментальных условиях использовали здесь, растения начинают цветение около 21 дней после пересадки от плиты фотосинтетическую и Скуг (МС) в почву. Семена, стра?…

Representative Results

Арабидопсис принадлежит к семейству Brassicacea, принимая соцветия цветками бисексуалов, организовал в цветет (рис. 1). Каждый цветок имеет четыре чашелистика, четырьмя лепестками, шесть тычинок (четыре длинный и два коротких) и синкарпная гинецея, состо…

Discussion

Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хор…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.