Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Summary

Vi beskriver en metod för framställning av humana antikroppar specifika för antigen av intresse, start från sällsynta B-celler som cirkulerar i blod. Generation av dessa naturliga antikroppar är snabbt och effektivt, och antikroppar erhållits kan diskriminera mellan starkt relaterade antigener.

Abstract

Monoklonala antikroppar (mAbs) är kraftfulla verktyg som är användbara för både grundforskning och i biomedicin. Deras hög specificitet är oumbärlig när antikroppen måste skilja mellan mycket relaterade strukturer (t.ex., ett protein som normal och en muterad version därav). Det nuvarande sättet att generera sådana diskriminerande mAbs innebär omfattande screening av flera Ab-producerar B-celler, vilket är både kostsamt och tidskrävande. Vi föreslår här en snabb och kostnadseffektiv metod för generering av diskriminerande, helt human mAbs start från humant blod cirkulerar B-lymfocyter. Originaliteten i denna strategi beror på valet av specifika antigen bindande B celler kombinerat med kampen mot valet av alla andra celler, med hjälp av lättillgängliga perifert blod mononukleära celler (PBMC). När specifika B-celler är isolerade, erhålls cDNA (kompletterande deoxiribonukleinsyra) sekvenser som kodar för den motsvarande mAb med enstaka cell omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) teknik och därefter uttryckt i mänskliga celler. Inom så lite som 1 månad är det möjligt att producera milligram mycket diskriminerande mänskliga mAbs mot valfri önskad antigen naturligt upptäcks av B-cell repertoaren.

Introduction

Den metod som beskrivs här tillåter snabb och mångsidig produktion av fullt humana monoklonala antikroppar (mAbs) mot en önskad antigen (Ag). mAbs är viktiga verktyg i många grundläggande forskning program in vitro och i vivo: flow flödescytometri, histologi, western-analys, och blockering experiment till exempel. Dessutom används mAbs mer och mer i medicin för behandling av autoimmuna sjukdomar, cancer, och att styra transplantation avslag¹. Anti-CTLA-4 och anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs användes exempelvis nyligen som immun checkpoint-hämmare i cancer behandlingar².

De första mAbs producerades av immunglobulin (Ig)-utsöndrar hybridomceller erhållits från mjälten cellerna av immuniserade möss eller råttor. Men hämmar det starkt immunsvaret mot murint eller råtta mAbs deras terapeutiska användning på människor, på grund av deras snabba clearance och sannolikt induktion av överkänslighet reaktioner³. För att tackla detta problem, har animaliskt proteinsekvenser av mAbs delvis ersatts av mänskliga sådana att generera så kallade chimär mus-mänskliga eller humaniserade antikroppar. Denna strategi minskar dock endast delvis immunogenicitet, samtidigt väsentligen öka både kostnaden och tidsskalan för produktion. En bättre lösning är att skapa mänskliga mAbs direkt från mänskliga B-celler och flera strategier för detta finns. En av dem är användningen av phage eller jäst display. Detta innebär att Visa variabla domäner från ett kombinatoriska bibliotek med slumpmässiga mänskliga Ig tung och ljus kedjor på Fager eller jäst, och genomför ett urval steg med specifika antigen av intresse. En stor nackdel med denna strategi är att tunga och lätta kedjor är slumpmässigt förknippade, leder till en mycket stor ökning i mångfalden av genererade antikroppar. Antikroppar som erhålls är osannolikt att motsvara till de som skulle uppstå genom en naturlig immunsvar mot en viss Ag. Övrigt mänskliga proteinveckning och post-translationella modifieringar återges inte systematiskt i prokaryoter eller ens i jäst. En andra mänskliga mAb produktionsmetod är immortalization av naturliga mänskliga B celler, av Epstein – Barr-virusinfektion eller uttryck av de anti-apoptotiska faktorer BCL-6 och BCL-XL⁴. Dock denna metod gäller endast för minne B celler och är ineffektiv, som kräver screening av talrika mAb-förevigade B celler att identifiera de få (om några) mAb-klonerna med önskad antigen specificitet. Metoden är således både kostsamt och tidskrävande.

Ett nytt protokoll har nyligen beskrivits för produktion av mänskliga mAbs från isolerade enda B celler⁵. Det bygger på en optimerad encelliga omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) för förstärkning av både tunga – och ljus-kedjan kodning segment från en enda sorterade B-cell. Detta följs av kloning och uttryck av dessa segment i en eukaryota uttryck systemet, vilket möjliggör återuppbyggnad av en fullt human mAb. Detta protokoll har använts framgångsrikt start från B-celler från vaccinerade givare. Celler skördats flera veckor efter vaccination att få högre frekvenser av B-celler som riktas mot önskad Ag, och därmed begränsa den tid som krävs för screening⁶. Andra helt human mAbs har också producerats från⁺ (humant immunbristvirus) HIV-infekterade patienter⁷ och melanom patienter⁸. Trots dessa framsteg finns det fortfarande inget förfarande som är tillgängliga som gör det möjligt för isolering av Ag-specifika B-celler som är oberoende av deras minne fenotyp eller frekvens.

Förfarandet beskrivs här leder till effektiv ex vivo isolering av mänskliga cirkulerande B celler baserat på deras BCR specificitet, följt av produktionen av fullt humana antigen-specifika mAbs i hög avkastning och med en låg screening tid. Metoden är inte begränsad till B-minnesceller eller antikropp-utsöndrar B celler inducerad efter ett immunsvar, men kan också tillämpas på mänskliga naiva B-celler repertoaren. Den funkar även start från Ag-specifika B-celler som är närvarande vid mycket låga frekvenser är en bra indikation på dess effektivitet. Principen för metoden är följande: perifert blod mononukleära celler (PBMC) färgas med två tetramers presenterar antigen av intresse, var märkt med en annan fluorokrom (t.ex., fykoerytrin (PE) och från (APC)), och en tredje tetramer presenterar ett närbesläktade antigen konjugerat med ett tredje fluorokrom (t.ex., Brillant Violet 421 (BV421)). För att berika för antigen-bindande celler, celler inkuberas därefter med pärlor belagd med anti-PE och anti-APC Abs, och sorterade i cell Separationskolonner. PE⁺ APC⁺ cell fraktionen är markerad, färgade med en mängd mAbs specifika för olika Laboratoriestammar celltyper att medge identifiering av B-celler och betvingade flöda flödescytometri cell sortering. B-celler som är PE⁺ och APC⁺, men lysande violett^–, är isolerade. Detta steg markerar räknaren celler som inte är B-celler eller binder inte till tetramerized antigen, men binda till antingen PE eller APC (dessa celler kommer att PE⁺ APC^– eller PE^– APC⁺) eller till den icke-antigen delen av de tetramers som används (dessa celler kommer att BV421⁺). B-celler inte mycket specifika för epitop av intresse väljs också kontraproduktivt i detta steg (dessa celler kommer också att vara BV421⁺). Denna metod kan således rena mycket specifika B-celler som uttrycker B-cellernas receptorer (BCR) kunna diskriminera mellan två mycket närbesläktade antigener. Enda specifika B-celler samlas i rör och deras PCR-förstärkta Ig cDNAs (kompletterande deoxiribonukleinsyra syror) klonade och uttryckt av en human cellinje som utsöndrade IgG mAbs.

Som ett proof of concept, denna studie beskriver effektiv generering av mänskliga mAbs, som erkänner en peptid som presenteras av en större histocompatibility komplex klass jag (MHC-jag) molekyl och kan diskriminera mellan denna peptid och andra peptider som lastats på samma MHC-jag allel. Även om graden av komplexitet i detta Ag är viktigt, kan med denna metod (i) hög kapacitet återvinning av Ag-specifika mAbs; (ii) produktion av mAbs kunna diskriminera mellan två strukturellt nära Ags. Detta tillvägagångssätt kan förlängas till vaccinerade eller infekterade patienter utan ändringar protokoll, och också redan har genomförts framgångsrikt i en humaniserad rat system⁹. Således, denna studie beskriver en mångsidig och effektiv strategi för att generera fullt humana mAbs som kan användas i grundforskning och immunterapi.

Protocol

Alla mänskliga perifert blodprover erhölls från anonym vuxen givare efter informerat samtycke, i enlighet med den lokala etiska kommittén (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, förfarande re NTS-2016-08). 1. isolering av människans perifera mononukleära blodceller Obs: Utgångsmaterial kan vara totalt perifert blod eller cytapheresis prover. Prover bör inte vara äldre än 8 h och kompletteras med antikoagulantia (t.ex., heparin). …

Representative Results

Start från PBMC från friska donatorer, detta projekt presenterar generationen av mänskliga mAbs, som erkänner peptiden Pp65495 (Pp65, från human cytomegalovirus) presenteras av klassen stora histocompatibility komplex jag (MHC-jag) molekylen HLA – A * 0201 () HLA-A2). Dessa mAbs kan diskriminera mellan detta komplex och komplex som representerar andra peptider som lastas den samma MHC-I molekylen. Laboratoriestam…

Discussion

Föreslagna protokollet är en kraftfull metod för generering av mänskliga mAbs direkt från Ag-specifika B-celler som cirkulerar i blodet. Den kombinerar tre viktiga aspekter: (i) användning av en tetramer-associerade magnetiska berikning, som tillåter en ex vivo -isolering av även sällsynta Ag-bindande B-celler; (ii) en Usenets strategi som använder tre Ag tetramers (två relevanta ettor och en irrelevant en) märkt med tre olika fluorokromer för att isolera, genom flödescytometri, bara de B-celler so…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003