Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Summary

Se describe un método para la producción de anticuerpos humanos específicos para un antígeno de interés, a partir de células B circulantes en la sangre humana. Generación de estos anticuerpos naturales es eficiente y rápido, y los anticuerpos obtenidos pueden discriminar entre antígenos muy similares.

Abstract

Anticuerpos monoclonales (mAbs) son poderosas herramientas útiles para tanto investigación fundamental y en biomedicina. Su alta especificidad es indispensable cuando el anticuerpo tiene que distinguir entre estructuras muy relacionadas (por ejemplo, una proteína normal y su una versión mutada). La actual forma de generar estos mAbs discriminativa implica investigación extensa de múltiples células B productoras de AC, que es costosa y consume tiempo. Proponemos aquí un método rápido y rentable para la generación de discriminativo, mAbs plenamente humana a partir de linfocitos B circulantes de sangre humana. La originalidad de esta estrategia es debido a la selección de antígeno específico células de Unión B combinada con la selección contra de todas las otras células, usando disponible periféricos sanguíneos mononucleares células (PBMC). Una vez que las células B específicas aisladas, secuencias de ADNc (complementario ácido desoxirribonucleico) que codifica para el mAb correspondiente se obtienen utilizando la tecnología de reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa (RT-PCR) unicelular y expresado posteriormente en humanos células. Dentro de tan poco como 1 mes, es posible producir miligramos de mAbs humano altamente discriminativo contra prácticamente cualquier antígeno deseado naturalmente detectado por el repertorio de células B.

Introduction

El método aquí descrito permite la producción rápida y versátil de anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) contra un antígeno deseado (Ag). mAbs son herramientas esenciales en muchas aplicaciones de investigación básica in vitro e in vivo: flujo cytometry, histología, experimentos de western-blotting y bloqueo, por ejemplo. Además, mAbs se utilizan más en medicina para tratar enfermedades autoinmunes, cáncer y para el control de rechazo de trasplante¹. Por ejemplo, mAbs anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recientemente fueron utilizados como inhibidores de control inmune en cáncer tratamientos².

Los mAbs primeros fueron producidos por inmunoglobulina (Ig)-secretoras de hibridomas obtienen de las células esplénicas de ratones inmunizados o ratas. Sin embargo, la fuerte respuesta inmune contra mAbs murino o rata impide su uso terapéutico en humanos, debido a su rápida separación y el probable inducción de reacciones de hipersensibilidad³. Para abordar este problema, secuencias de la proteína animal de mAbs han sido parcialmente reemplazadas por los humanos para generar anticuerpos de ratón-humano o humanizados quiméricos llamados. Sin embargo, esta estrategia sólo parcialmente disminuye la inmunogenicidad, aumentando substancialmente el costo y la escala de tiempo de producción. Hay varias estrategias para esto y una mejor solución es generar mAbs humana directamente de las células B humanas. Uno de ellos es el uso de la visualización de fagos o levadura. Se trata de mostrar los dominios variables de una biblioteca combinatoria de Ig humana al azar pesado y luz cadenas en fagos o levaduras y llevar a cabo un paso de selección utilizando el antígeno específico de interés. Un gran inconveniente de esta estrategia es que las cadenas pesadas y ligeras están aleatoriamente asociadas, llevando a un incremento muy grande en la diversidad de los anticuerpos generados. Anticuerpos obtenidos no corresponden a las que surgirían de una respuesta inmune natural contra un Ag particular. Por otra parte, plegamiento de la proteína humana y modificaciones postraduccionales no son sistemáticamente reproducidas en procariotas o en levaduras. Un segundo método de producción humana mAb es la inmortalización de células B humanas naturales, por infección del virus Epstein – Barr o expresión de los factores anti-apoptótica BCL-6 y BCL-XL⁴. Sin embargo, este método sólo es aplicable a las células de memoria B y es ineficiente, que requieren la proyección de numerosos mAb inmortalizado B células productoras para identificar los clones de mAb pocos (si cualquier) con la especificidad antigénica deseada. El método es costoso y desperdiciador de tiempo.

Un nuevo protocolo recientemente se ha descrito para la producción de mAbs humano aislado solo de células B⁵. Se basa en un optimizado unicelular revertir la transcripción-polimerasa reacción en cadena (RT-PCR) para la amplificación de ambos la pesada luz cadena y codificación de segmentos de una sola célula B ordenado. Esto es seguido por la clonación y expresión de estos segmentos en un sistema de expresión eucariotas, lo que permite la reconstrucción de un mAb plenamente humana. Este protocolo se ha utilizado con éxito a partir de las células de B de donantes vacunados. Las células se cosecharon varias semanas después de la vacunación para obtener frecuencias más altas de las células B contra el Ag deseado y así limitar el tiempo requerido para la detección del⁶. También se han producido otros mAbs plenamente humanas de infectados por el VIH⁺ (Virus de inmunodeficiencia humana) pacientes⁷ y melanoma pacientes⁸. A pesar de estos avances, todavía hay no hay procedimiento disponible que permite el aislamiento de células B Ag específica independientemente de su fenotipo de memoria o de frecuencia.

El procedimiento aquí descrito conduce a aislamiento eficiente ex vivo de las células B humanas circulantes basados en su especificidad BCR, seguido por la producción de plenamente humana mAbs específicos de antígeno en alto rendimiento y con un tiempo de proyección baja. El método no se limita a las células de memoria B o células B secretoras de anticuerpos inducidas después de una respuesta inmune, pero puede aplicarse también al repertorio de células B humanos ingenuos. Que funciona incluso a partir de las células B Ag-específica presentes en muy baja frecuencia es un buen indicador de su eficacia. El principio del método es como sigue: se tiñen las células mononucleares periféricas en sangre (PBMC) con dos tetrámeros que presentan el antígeno de interés, cada uno marcado con un fluorocromo diferente (por ejemplo, ficoeritrina (PE) y Allophycocyanin (APC)), y un tercer tetrámero que presenta un antígeno estrechamente relacionado conjugado con un fluorocromo terceros (p. ej., brillante violeta 421 (BV421)). Para enriquecer las células de antígeno-que ata, las células se incuban luego con bolas recubiertas con anti-PE y Abs anti-APC y ordenados en columnas de separación celular. La fracción de células APC PE^{+ +} es seleccionada, manchadas con una variedad de mAbs específicos para diferentes tipos de células PBMC permitir la identificación de las células B y sometida a clasificación de celda de citometría de flujo. Las células de B PE⁺ y APC⁺, pero brillante violeta^–, están aisladas. Este paso selecciona en células que no son las células de B o no se unen al antígeno tetramerized, pero unen a PE o APC (estas células serán PE⁺ APC^– o PE^– APC⁺) o a la parte no-antígeno de los tetrámeros usado (estos las células serán BV421⁺). Las células de B no altamente específicas para el epitopo de interés también se seleccionan en este paso (estas células también será BV421⁺). Por lo tanto, este método puede purificar células B altamente específicas expresan receptores de las células B (BCR) capaces de discriminar entre antígenos relacionados muy de cerca conexos dos. Las células B específicas se recogen en tubos y su cDNAs de la polimerización en cadena-amplificados de la Ig (los ácidos desoxirribonucleico complementarios) clonado y expresado por una línea de células humanas como mAbs IgG secretada.

Como una prueba de concepto, este estudio describe la generación eficiente de mAbs humanos, que reconoce un péptido presentado por una clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula y puede discriminar entre este péptido y otros péptidos cargados en el mismo MHC-I alelo. Aunque el nivel de complejidad de este Ag es importante, este método permite (i) recuperación de alto rendimiento de mAbs específicos de Ag; (ii) producción de mAbs capaces de discriminar entre dos estructuralmente cerca de Ags. Este enfoque puede ser extendido a pacientes infectados o vacunados sin ninguna modificación del protocolo y también ya ha sido implementado con éxito en un sistema humanizado de la rata del⁹. Por lo tanto, este estudio describe un enfoque versátil y eficiente para generar mAbs plenamente humana que pueden ser utilizados en la inmunoterapia y la investigación básica.

Protocol

Todas las muestras de sangre periférica fueron obtenidas de donantes adultos anónimos después de consentimiento informado, según el Comité de ética local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedimiento Sampler NTS-2016-08). 1. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica Nota: Material de partida puede ser sangre total periférica o cytapheresis muestras. Las muestras no deben ser mayores de 8 h y complementan con los anticoagulantes …

Representative Results

A partir de PBMC procedentes de donantes sanos, presenta proyecto la generación de mAbs humana, que reconocen el péptido Pp65495 (Pp65, de citomegalovirus humano) presentado por la clase complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I) molécula (HLA – A * 0201 HLA-A2). Estos mAbs pueden discriminar entre este complejo y complejos que representan otros péptidos cargados en el mismo MHC-I molécula. PBMC fueron manch…

Discussion

El protocolo propuesto es un método eficaz para la generación de mAbs humana directamente de las células B Ag específicos circulantes en la sangre. Combina tres aspectos importantes: (i) el uso de un enriquecimiento magnético asociado de tetrámero, que permite un aislamiento ex vivo incluso raras Unión Ag de células de B; (ii) una estrategia bloquea que utiliza tres tetrámeros Ag (dos relevantes y uno irrelevante) etiquetados con tres fluorocromos diferentes para aislar, mediante citometría de flujo, s…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
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3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
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5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
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3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
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5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
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3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003