Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Summary

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Abstract

Monoklonal antikor (mAbs) güçlü her iki temel araştırma ve Biyomedikal yararlı araçlardır. Antikor (örneğin, bir normal protein ve bunların mutasyona uğramış bir sürüm) son derece ilgili yapılar arasında ayırt etmek gerektiğinde yüksek olmalarından vazgeçilmezdir. Böyle discriminative mAbs üreten geçerli yolu, pahalı ve zaman alıcı olan birden fazla Ab üreten B hücrelerinin geniş tarama içerir. Biz burada tamamen insan mAbs B lenfositler dolaşan kan grubundan başlayan discriminative, nesil için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem öneriyorum. Diğer tüm hücrelerin hazır periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanarak karşı seçim ile kombine spesifik antijen bağlayıcı B hücre seçimini bu strateji özgünlük kaynaklanmaktadır. Belirli B hücreleri izole olduğunda, karşılık gelen mAb için kodlama cDNA (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) dizileri tek hücre ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) teknolojisini kullanan ve daha sonra insan ifade elde edilir hücreleri. Gibi az içinde 1 ay olarak, doğal olarak B hücre repertuar tarafından algılanan hemen hemen herhangi bir istenen antijen karşı son derece discriminative insan mAbs miligram üretmek mümkündür.

Introduction

Burada açıklanan yöntemi istenen antijen (Ag) karşı tamamen insan Monoklonal antikor (mAbs) hızlı ve çok yönlü üretimini sağlar. mAbs birçok temel araştırma uygulamaları içinde in vitro ve in vivotemel araç vardır: Örneğin Akış Sitometresi, Histoloji, western Blot, engelleme deneyleri. Ayrıca, mAbs daha fazla tıpta otoimmün hastalıklar, kanser, tedavisi için ve nakli ret¹kontrol etmek için kullanılıyor. Örneğin, anti-CTLA-4 ve anti-PD-1 (ya da anti-PD-L1) mAbs son zamanlarda kanser tedavileri²bağışıklık denetim noktası inhibitörleri olarak kullanılmıştır.

İlk mAbs immünglobulin (Ig) tarafından üretildi-hybridomas salgılayan aşılı fare ya da sıçan dalak hücrelerinden elde. Ancak, fare ya da sıçan mAbs karşı güçlü bağışıklık yanıtı hızlı onların temizlik ve aşırı duyarlılık reaksiyonları³olası indüksiyon nedeniyle insanlarda terapötik kullanımları engellemektedir. Bu sorunu çözmek için hayvansal protein dizileri mAbs kısmen sözde chimeric fare-insan veya insanlaşmış antikorlar oluşturmak için insan olanlar tarafından değiştirilmiş. Ancak, bu strateji yalnızca kısmen önemli ölçüde maliyet ve zaman ölçekli üretim artırırken immünojenisite, azaltır. İnsan mAbs doğrudan insan B hücreleri oluşturmak için daha iyi bir çözümdür ve bunun için çeşitli stratejiler mevcuttur. Onlardan biri fajının veya Maya display kullanımıdır. Bu rastgele insan IG ağır Kombinatorik kitaplığından değişken etki alanları görüntüleme içerir ve ışık phages veya Mayalar ve ilgi spesifik antijen kullanarak bir seçim adım taşıyan zincirleri. Bu stratejinin büyük bir dezavantaj ağır ve hafif zincirleri rastgele ilişkili, çok büyük bir artış için oluşturulan antikorlar çeşitlilik içinde lider olmasıdır. Elde edilen antikor üzerinden belirli bir Ag karşı doğal bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkacak karşılık gelmesi olası değildir. Ayrıca, insan protein katlanması ve translasyonel modifikasyonlar sistematik olarak prokaryot ve Mayalar hatta çoğaltılamaz değil. İkinci bir insan mAb üretim yöntem doğal insan B hücreleri, Epstein – Barr virüsü enfeksiyonu veya anti-apoptotik faktörler BCL-6 ve BCL-XL⁴ifade tarafından əbadoləşdirmək olduğunu. Ancak, bu yöntem yalnızca bellek B hücreleri için geçerlidir ve az (varsa) mAb klonlar istenen antijenik özgüllük ile tanımlamak için çok sayıda mAb üreten ölümsüzleştirdi B hücreleri ile taranması gerektiren verimli değildir. Böylece pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir.

Yeni bir protokol son zamanlarda insan mAbs izole tek B hücreleri⁵üretiminin tarif edilmiştir. Bunun üzerine bir en iyi duruma getirilmiş tek hücreli ters transkripsiyon-Polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) amplifikasyon her iki ağır – ve ışık-segmentleri bir tek sıralanmış B hücreden kodlama zinciri için dayanır. Bu böylece tamamen insan mAb yeniden inşası izin bir ökaryotik ifade sisteminde, klonlama ve ifade Bu kesimler tarafından takip ediyor. Bu iletişim kuralı başarıyla B hücreleri aşı bağışçılardan başlayarak kullanılmıştır. Hücreleri birkaç hafta sonra aşı B hücre istenen Ag karşı yönetmen yüksek frekansları almak ve böylece⁶eleme için gereken süreyi sınırlamak için hasat edildi. Tamamen insan diğer mAbs aynı zamanda enfekte HIV⁺ (insan immün yetmezlik virüsü) hastalar⁷ ve melanom hastalarda⁸üretilmektedir. Bu gelişmeler rağmen bu hala bir işlemdir Ag özgü B hücreleri kendi bellek fenotip veya frekans bağımsız yalıtım sağlayan kullanılabilir.

Prosedür tanımlamak burada verimli ex vivo yalıtım insan dolaşımdaki B hücreleri tamamen insan antijen spesifik mAbs yüksek verim ve düşük tarama süresi ile üretim ardından BCR olmalarından temel yol açar. Yöntem bellek B hücreleri veya antikor salgılayan B hücreleri bağışıklık yanıtının sonra indüklenen için sınırlı değildir, ama insan naif B hücre repertuar için de uygulanabilir. O bile Ag özgü B hücreleri çok düşük frekanslarda mevcut başlayarak inşaat verimlilik iyi bir göstergesidir. Yönteminin prensibi aşağıdaki gibidir: periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) iki tetramers faiz antijen sunan lekeli, her bir farklı fluorochrome ile (örneğin, Phycoerythrin (PE) ve Allophycocyanin (APC)), etiketli ve üçüncü bir tetramer yakından ilgili bir antijen sunan bir üçüncü fluorochrome ile (örneğin, parlak mor 421 (BV421)) Birleşik. Antijen bağlayıcı hücreleri için zenginleştirmek için hücreleri daha sonra anti-PE ile kaplı boncuk ile inkübe ve anti-APC Abs ve hücre ayrılık sütunlarda sıralanabilir. PE⁺ APC⁺ hücre kesir, mAbs farklı PBMC hücre türlerine B hücreleri tanımlanmasına izin özgü çeşitli lekeli ve tabi Akış Sitometresi hücre sıralama için seçilir. PE⁺ ve APC⁺, parlak mor^–, ama olan B hücreleri izole edilmiştir. Bu adımı karşı olan B hücreleri olmayan veya tetramerized antijen bind yapmak ama ya PE veya APC (Bu hücreler PE⁺ APC^– veya PE^{– +}APC olacak) veya tetramers (Bunlar kullanılan antijen parçası bağlamak hücreleri seçer hücre-ecek var olmak BV421⁺). B hücreleri değil son derece ilgi epitope için belirli karşı bu adımda belirlenmişse de (Bu hücreler-ecek da var olmak BV421⁺). Bu nedenle, bu yöntem B-hücre reseptörleri (BCRs) iki çok yakından ilgili antijenleri arasında ayrımcılık mümkün ifade son derece belirli B hücreleri arındırmak. Tek belirli B hücreleri tüplerde toplanır ve onların PCR güçlendirilmiş IG cDNAs (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) klonlanmış ve tarafından salgılanan IgG mAbs insan hücre çizgilerle ifade.

Kavramının bir kanıtı olarak, bu çalışmada bir peptid ben MHC kompleksi sınıf tarafından sunulan tanıyan insan mAbs, verimli nesil açıklar (MHC-ben) molekül ve bu peptid ve aynı yüklü diğer peptidler arasında ayırt edebilirsiniz MHC-ben gen. Bu AG karmaşıklık düzeyi önemli olmakla birlikte, bu yöntem, (i) Ag özel mAbs yüksek verimli kurtarma sağlar; (ii) üretim mAbs iki yapısal olarak yakın Ags arasında ayırımcılık yapması mümkün. Bu yaklaşım herhangi bir iletişim kuralı yapılmaksızın aşı veya enfekte hastalar için genişletilmiş ve ayrıca zaten başarıyla bir insanlaşmış sıçan sistem⁹‘ uygulamaya konmuştur. Böylece, bu çalışmada temel araştırma ve immünoterapi kullanılabilir tamamen insan mAbs oluşturmak için çok yönlü ve verimli bir yaklaşım açıklar.

Protocol

Tüm insan periferik kan örnekleri anonim yetişkin bağışçılardan uygun olarak yerel Etik Komitesi (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, yordam Yayındayız NTS-2016-08) aydınlatılmış onam sonra elde edilmiştir. 1. insan periferik kan mononükleer hücre izolasyon Not: malzeme başlayan toplam insan periferik kan ya da cytapheresis örnekleri olabilir. Örnekleri 8 h büyük olmamalıdır ve antikoagülanlar (örneğin, heparin) ile destek…

Representative Results

PBMC bu proje hediye peptid Pp65495 tanıyan insan mAbs, nesil sağlıklı bağışçılardan başlayan (Pp65, insan Sitomegalovirüs üzerinden) sunulan MHC kompleksi sınıf tarafından ben (MHC-ben) molekül HLA – A * 0201 () HLA-A2). Bu mAbs bu karmaşık ve aynı MHC yüklenen diğer peptidler temsil eden konut projeleri arasında ayırt edebilirsiniz-ben molekül. PBMC HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC ve yukarıd…

Discussion

Önerilen protokol doğrudan kanda dolaşan Ag özgü B hücreleri insan mAbs üretimi için güçlü bir yöntem olmasıdır. Bu üç önemli yönleri birleştirir: (i) bile nadir Ag bağlayıcı B hücreleri; bir ex vivo yalıtım sağlayan bir tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme, kullanımı (II) etiketli üç Ag tetramers (iki ilgili olanlar ve bir alakasız bir) ile üç farklı fluorochromes izole, Akış Sitometresi tarafından yalnızca B hücreleri BCR belirli istenen Ag için bir ifade kullanı…

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003