Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert
Summary
Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.
Abstract
Monoclonal antilichamen (mAbs) zijn krachtige instrumenten nuttig voor zowel fundamenteel onderzoek en medische biologie. Hun hoge specificiteit is onmisbaar wanneer het antilichaam moet onderscheid worden gemaakt tussen sterk verwante structuur (b.v., een normaal eiwit en een gemuteerde versie ervan). De huidige manier van het genereren van dergelijke discriminerende mAbs omvat uitgebreide screening van meerdere B Ab-producerende cellen, die is zowel duur en tijdrovend. Wij stellen hier een snelle en kosteneffectieve methode voor de generatie van discriminatoire, volledig mens mAbs vanaf menselijk bloed circuleren van B-lymfocyten. De originaliteit van deze strategie is te wijten aan de celselectie specifiek antigeen bindende B gecombineerd met de contra selectie van alle andere cellen, met behulp van gemakkelijk beschikbare perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zodra bepaalde B-cellen geïsoleerd zijn, worden cDNA (bijkomende deoxyribonucleic acid) sequenties codering voor de overeenkomstige mAb verkregen met behulp van eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) technologie en vervolgens uitgedrukt in mens cellen. Binnen zo weinig als 1 maand is het mogelijk om te produceren milligram van hoogst discriminatoire menselijke mAbs gericht tegen vrijwel elke gewenste antigeen natuurlijk gedetecteerd door de B-cel-repertoire.
Introduction
De hier beschreven methode kan de snelle en veelzijdige productie van volledig menselijke monoklonale antistoffen (mAbs) tegen een gewenste antigeen (Ag). mAbs zijn essentiële instrumenten in veel basisonderzoek toepassingen in vitro en in vivo: stroom cytometry, histologie, westelijke bevlekken en blokkerende experimenten bijvoorbeeld. Bovendien worden mAbs gebruikt meer en meer in de geneeskunde voor de behandeling van auto-immuunziekten, kanker, en zo de besturing van transplantatie afwijzing1. Bijvoorbeeld, werden de anti-CTLA-4 en anti-PD-1 (of anti-PD-L1) mAbs onlangs gebruikt als immuun checkpoint-remmers in kanker behandelingen2.
De eerste mAbs werden geproduceerd door immunoglobuline (Ig)-afscheidende hybridomas verkregen uit de milt cellen van geïmmuniseerde muizen of ratten. Echter, de sterke immuunrespons tegen RattenUitrustingen of rat mAbs belemmert hun therapeutisch gebruik bij de mens, als gevolg van hun snelle goedkeuring en de waarschijnlijke inductie van overgevoeligheid reacties3. Om dit probleem aan te pakken, zijn dierlijke eiwitten sequenties van mAbs gedeeltelijk vervangen door menselijke degenen voor het genereren van zogenaamde Chimeer muis-mens of gehumaniseerd antilichamen. Deze strategie vermindert echter slechts gedeeltelijk immunogeniciteit, terwijl zowel de kosten en de tijd-schaal van de productie aanzienlijk te verhogen. Een betere oplossing is het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks uit menselijke B-cellen en verschillende strategieën daarvoor zijn beschikbaar. Een van hen is het gebruik van bacteriofaag of gist display. Hierbij weergeven van variabele domeinen vanuit een combinatorische bibliotheek met willekeurige menselijke Ig zware en lichte kettingen op bacteriofagen of gisten en het uitvoeren van een selectie stap met behulp van het specifieke antigeen van belang. Een groot nadeel van deze strategie is dat zware en lichte kettingen willekeurig gekoppeld zijn, leidt tot een zeer grote toename in de diversiteit van de gegenereerde antilichamen. Antilichamen verkregen zijn onwaarschijnlijk overeen moeten komen met degenen die uit een natuurlijke immuunrespons tegen een bepaalde Ag voortvloeien zou. Bovendien, menselijke eiwitvouwing en posttranslationele modificaties zijn niet systematisch gereproduceerd in prokaryoten of zelfs in gisten. Een tweede menselijke mAb productiemethode is de immortalization van natuurlijke menselijke B cellen, door Epstein – Barr virusinfectie of expressie van de anti-apoptotic factoren BCL-6 en BCL-XL4. Echter, deze methode is alleen van toepassing op geheugencellen B en is inefficiënt, vereisen screening van talrijke mAb-producerende vereeuwigd B cellen te identificeren van de weinig (eventuele) mAb-klonen met de gewenste antigene specificiteit. De methode is dus zowel dure en tijdrovende.
Onlangs werd een nieuw protocol voor de productie van menselijke mAbs van geïsoleerde één B cellen5beschreven. Zij beroept zich op een geoptimaliseerde eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor versterking van zowel de zware – en licht-keten segmenten van een enkele cel voor gesorteerde B-codering. Dit wordt gevolgd door het klonen en de uitdrukking van deze segmenten in een eukaryoot expressie systeem, waardoor de wederopbouw van een volledig mens mAb. Dit protocol is gebruikt met succes vanaf B cellen van gevaccineerde donoren. Cellen zijn enkele weken na de vaccinatie verkrijgen van hogere frequenties van B-cellen die gericht is tegen de gewenste Ag, en dus het beperken van de tijd die nodig is voor het screenen van6geoogst. Er zijn ook andere volledig menselijk mAbs verkregen uit HIV+ (Human Immunodeficiency Virus) besmette patiënten7 en melanoom patiënten8. Ondanks deze vooruitgang is er nog steeds geen procedure beschikbaar waarmee het isolement van de Ag-specifieke B cellen onafhankelijk van hun geheugen fenotype of frequentie.
De procedure beschreven hier leidt tot efficiënte ex vivo isolatie van menselijke circulerende B cellen op basis van hun BHG specificiteit, gevolgd door de productie van volledig menselijk antigeen-specifieke mAbs in hoog rendement en met een tijd van lage screening. De methode is niet beperkt tot de geheugencellen B of antilichaam-afscheidende B cellen na een immuunrespons veroorzaakte, maar kan ook worden toegepast op het repertoire van de B-cel menselijke naïef. Dat het werkt zelfs vanaf Ag-specifieke B-cellen aanwezig bij zeer lage frequenties is een goede indicatie van de efficiëntie. Het uitgangspunt van de methode is als volgt: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gekleurd met twee tetramers het antigeen van belang presenteren, elk gemarkeerd met een verschillende fluorescerende (b.v.Phycoerythrin (PE) en Allophycocyanin (APC)), en een derde tetrameer presenteren een verwant antigeen geconjugeerd met een derde fluorescerende (bijvoorbeeldBrillant Violet 421 (BV421)). Om te verrijken voor antigeen-bindende cellen, cellen worden vervolgens geïncubeerd met kralen met anti-PE gecoat en anti-APC Abs, en in cel scheiding kolommen gesorteerd. De Fractie van de cel PE+ APC+ is geselecteerd, gekleurd met een scala aan mAbs specifiek voor verschillende PBMC celtypes toe te staan van de identificatie van B-cellen, en onderworpen aan stroom cytometry cel sorteren. B-cellen die PE+ en APC+, maar briljante Violet–, zijn geïsoleerd. Deze stap selecteert tegen cellen die geen B-cellen of niet binden aan de tetramerized antigeen, maar binden aan PE of APC (deze cellen zullen PE+ – APC of PE– APC+) of aan het deel van de niet-antigeen van de tetramers gebruikt (deze cellen zullen BV421+). B-cellen niet zeer specifiek voor de epitoop van belang zijn ook contra geselecteerd bij deze stap (deze cellen zullen ook BV421+). Dus, kan deze methode zeer specifieke B-cellen, uiting van B-cel receptoren (BCRs) te discrimineren tussen twee zeer nauw verwante antigenen kunnen zuiveren. Enkele specifieke B-cellen worden verzameld in buizen en hun PCR-versterkte Ig cDNAs (complementaire deoxyribonucleic zuren) wordt gekloond en wordt geuit door een menselijke cellijn als secreted IgG mAbs.
Als een proof of concept, deze studie beschrijft de efficiënte generatie van menselijke mAbs, die herkennen een peptide gepresenteerd door een grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul en kan onderscheid maken tussen dit peptide en andere peptiden geladen op dezelfde MHC-ik allel. Hoewel het niveau van complexiteit van deze Ag is belangrijk, kunt met deze methode (i) hoge opbrengst herstel van Ag-specifieke mAbs; (ii) de productie van mAbs staat te discrimineren tussen twee structureel sluit Ags. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot gevaccineerde en besmette patiënten zonder enige wijziging van het protocol, en ook al met succes is uitgevoerd in een gehumaniseerd rat systeem9. Deze studie beschrijft dus, een veelzijdige en efficiënte aanpak voor het genereren van volledig menselijk mAbs die kunnen worden gebruikt in basisonderzoek en immunotherapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voorgestelde protocol is een krachtige methode voor het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks vanuit Ag-specifieke B-cellen in het bloed circuleren. Het combineert drie belangrijke aspecten: (i) het gebruik van een tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking, waarmee een ex vivo isolatie van zelfs zeldzame Ag-bindende B cellen; (ii) een gating strategie die gebruikmaakt van drie Ag tetramers (twee relevante enen en één irrelevant) geëtiketteerd met drie verschillende fluorochromes te isoleren, doo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Cytometry faciliteit “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor deskundige technische bijstand. Wij danken ook al het personeel van de productie van recombinante eiwitten (P2R) en IMPACT platformen (INSERM 1232 SFR Santé, Biogenouest, Nantes) voor hun technische ondersteuning. Wij danken Emmanuel Scotet en Richard Breathnach voor constructieve opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd financieel ondersteund door het IHU-Cesti project gefinancierd door de Franse regering «Investissements d’Avenir» programma, beheerd door de Franse nationale onderzoek Bureau (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door de Nantes Métropole en Région Pays de la Loire. Dit werk werd gerealiseerd in het kader van het programma van de LabEX IGO ondersteund door de National Research Agency via de investering van het toekomstige programma ANR-11-LABX-0016-01.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
