Summary
Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.
Abstract
תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.
Introduction
Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומצי תרבות בינוני
-
הכנה של שליטה (pH 7.4) ו pH נמוך (pH 6.8) תרבות בינוני
- להמיס 4.75 גר' אבקת DMEM בלי-גלוטמין 500 מ ל מים.
- להכין פתרון3 NaHCO 0.33 M בבקבוק לחץ חזק.
שים לב: חשוב להשתמש בקבוק לחץ חזק מאז NaHCO3 פולט גז2 CO, כאשר הם מחוממים, תרמית מפורקת. - אוטוקלב המדיום, פתרון. לאפשר מאגרים אלה להצטנן עד 25 מעלות צלזיוס.
- הוסף 5 מ ל-200 מ מגלוטמין, 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 50 מ של העובר סרום שור עד 500 מ"ל של DMEM בלי ביקרבונט.
- שליטה (pH 7.4) בינונית, להוסיף 2.4 מ של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט. בינוני נמוך-pH (pH 6.8), הוסיפו 0.6 מ"ל של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט.
- בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
הערה: כמות NaHCO3 פתרון צריכה תיקון בהתאם רמת החומציות בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO של החממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, בפעם הראשונה, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט כדי לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO פתרון3 כדי להוסיף DMEM.- לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי.
הערה: NaHCO3 פתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, צריך להיות מוכן טרי כל מדיה. המוצרים הנמכרים בו ניתן להשתמש במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.
- לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי.
-
הכנת לקטאט-induced או HCl-induced בינונית תרבות חומצי
- להוסיף µL 74 של לקטט פתרון או µL 125 של 1 M HCl 100 מ של שליטה בינונית (להכין בשלב 1.1.5).
- בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
הערה: כמות חומצת החלב או HCl פתרון גם צריך להיות מותאם על פי ה-pH בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO חממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם לקטט טורי או HCl ריכוזים כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור התאמת רמת ה-pH הרצוי של המדיום.
2. קצירת וטיפול בתאי
- להתחיל לטפח תאים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לפחות שבוע אחד לפני ביצוע ניסויים.
הערה: הקווים תא השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים. - מעבר תאים כאשר הם מגיעים confluency 70-90%. אל תאפשר את התאים להפוך confluent. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים בזמן התרגול היומי.
- לשטוף את התאים על-ידי הוספת 5 מ"ל PBS. האחות של PBS ומוסיפים אנזים התולש כגון 1 מ"ל טריפסין.
- דגירה ב 37 ° C עד התאים מעוגלים, נתחיל לנתק.
- הוסף 5 מ של תרבות בינוני על התאים מנותקת, לנטרל אנזים. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים תרבות בינונית.
- לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan-כחול.
- זרע 5.0 x 105 תאים/טוב של מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
- האחות המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות חומצי מוכן בסעיף 1. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.
3. RNA בידוד
- האחות תרבות בינוני ולשטוף תאים עם 5 מ"ל PBS. לשבש את התאים על-ידי הוספת ריאגנט החילוץ RNA (ראה טבלאות של חומרים).
- לגרד את המאכל לזמן קצר, ואז להסיר הכימית החילוץ RNA עם פיפטה, להפקיד את ה-RNA החילוץ ריאגנט תא lysate לתוך צינור 1.5 מ. יוצאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- להוסיף 250 µL כלורופורם, לנער את הצינור נמרצות תעזוב ס' 15 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואני צנטריפוגה-≥8, 000 g x עבור 5 דקות.
- הסר בזהירות את פאזה מימית באמצעות פיפטה. להשאיר חלק השלב מימית. מקום אחר צינור 1.5 מ.
- מוסיפים אלכוהול איזופרופיל µL 550 לשלב מימית ומערבבים בעדינות. להשאיר בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה במהירות מירבית (≥ 20, 000 x g) במשך 20 דקות ב 4 º C.
- יוצקים את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף מים מטופלים 1 מ"ל אתנול 75% ב- DEPC. מערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 8000 g x במשך 5 דקות.
- פיפטה הנחה אתנול ולתת שכדורי מילה נהדרת.
- להוסיף שמים מטופלים כ- 15-25 µL (בהתאם התשואה) של DEPC כדי בגדר RNA. מערבבים ביסודיות.
- למדוד את הריכוז של RNA מבודדים על ידי מדידת OD-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
4. cDNA סינתזה
- שילוב הרכיבים הבאים בשפופרת תגובת ה-PCR: עד 5 µg הכולל RNA, 1 µL Oligo dT (50 מיקרומטר) או ערבוב אקראי פריימר (60 מיקרומטר), 1 dNTP 10 מ מ µL, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 14 µL.
- לערבב, בקצרה centrifuge הרכיבים באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). Denature המדגם RNA/פריימר למשך 5 דקות ב 65 º C. ספין בקצרה (~ 5 s) באמצעות benchtop קטן צנטריפוגה, שים המדגם מיד על קרח לפחות 1 דקות.
- הוסף את המרכיבים הבאים: 4 µL 5 x מאגר שעתוק לאחור, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (200 U/µL), 1 µL RNase מעכב (40 U µL).
הערה: דוגמאות ערכות זמינים מסחרית מוצגות בטבלה של חומרים - קאפ הצינור, לערבב ולאחר מכן centrifuge בקצרה את תוכן באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). דגירה תערובת התגובה משולב ב 50-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- בטל את התגובה על ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. מדידה של ביטוי גנים חומצה מגיב באמצעות PCR בזמן אמת
- לשלב את המרכיבים הבאים בצלחת תגובה 384-ובכן: 1 µL תבנית cDNA, 0.75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X, 0.3 µL 50 מיקרומטר קדימה פריימר, 0.3 µL 50 מיקרומטר הפוך תחל, אנזימים µL 1, µL 2.5 10 x Taq פולימראז מאגר, 2.5 µL dNTP 20 מ מ, 16.65 µL מים.
הערה: דוגמה של ערכות זמינים מסחרית מוצגים בטבלה של חומרים. רשימת צבעי יסוד מוצג בטבלה 1. צלחת 96-ובכן התגובה יכול לשמש גם בשלב זה. ניתן להשתמש גם הגששים אחרים (למשל, Taqman בדיקה). - הגדרת הניסוי ואת התוכנית הבאה של ה-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת: 50 º C למשך 2 דקות, מחזור 1; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1; 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות, 40 מחזורי; 95 ° C 15 s, מחזור 1; 60 ° C 15 s, מחזור 1; 95 ° C 15 s, מחזור 1.
- מקם את הצלחת המכשיר qPCR. הפעלת התוכנית.
הערה: קולטנים Upregulation של גנים מגיב pH MSMO1, INSIG1ו- IDI1 נמדד על ידי רמות החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע ריכוז ביקרבונט המתאים, אנו מוכן DMEM בטווח של 0 - 8 מ"מ NaHCO3 (סופי ריכוז במדיום תרבות), הצליח בהכנת תרבות המדיה עם pH החל 6.4-7.4 (איור 1). הכנו DMEM עם 8 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4) שליטה בינוני, ו 2 מ מ NaHCO3 (pH 6.8) כמדיום עם pH חומצי לפי הדוח הקודם וקבע כי ה-pH חוץ-תאית מגיע ל- pH 6.8 עבור גידולים מוצקים4,5. ה-pH של המדיום חומצי. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, והוא ירד בהדרגה עד בערך pH 6.6 72 h במהלך התרבות של PANC-1 ו- AsPC-1 תאים (איור 2). הבא, כדי לקבוע את כמות חומצת החלב או HCl נדרש כדי להתאים את המדיום שליטה (pH 7.4) ל pH 6.8, אנו להוסיף כמויות שונות של לקטט או HCl המדיום שליטה למדוד את רמת החומציות של המדיום ואני נמצא כי ה-pH של המדיום שליטה עם מיומנויות ריכ הסופי n של 22.5 מ מ 6.25 HCl ו לקטט מיקרומטר להגיע ערך של 6.8 (איור 3).
ההשפעה של acidification חוץ-תאית באמצעות מדיום עם pH נמוך ניתן בקלות להעריך בהתבסס על קולטנים upregulation של גנים מגיב pH חומצי כגון MSMO1, IDI1ו- INSIG1. ביטוי של גנים אלה היה גדל מאוד תחת pH נמוך בהשוואה שלהם ביטוי תחת היפוקסיה או מזין רעב (איור 4). בנוסף, קולטנים upregulation של גנים אלה לא היה ספציפי למדיום שבו ה-pH חומצי נגרם על ידי רמות ביקרבונט מופחתת, היו גם upregulated על-ידי מדיום שבו pH חומצי נגרם על ידי התוספת של חומצת החלב ו/או HCl (איור 5). השוואה של הסלולר התגובות המדיה שבה ה-pH חומצי נגזרת ברמות ביקרבונט מופחת או התוספת של חומצת החלב או HCl מאפשרת לנו לקבוע אם תגובות הסלולר הן ספציפיות לסוגים מסוימים של acidification. קולטנים Upregulation של הגנים האחראים pH חומצי כגון IDI1, MSMO1, INSIG1 תחת חוץ-תאית pH נמוך מתרחשת גם תאים נורמליים (איור 6), כך שניתן להחיל את השיטה שלנו לא רק תאים סרטניים אלא גם תאים נורמליים. בתנאי pH גבוה, רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH לא היה upregulated PANC-1, AsPC-1 תאים (איור 7), אשר יכול לשמש בקרה שלילית.
איור 1. הקשר בין ריכוז3 NaHCO לבין תואר דוקטורט בינונית הציר האופקי מראה ריכוז של NaHCO3 ואת הציר האנכי מראה pH בינוני ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. שינוי pH בינוני בינוני תרבות נמוכה-pH (pH 6.8) במהלך 72 h-תרבות- PH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, ירד בהדרגה במשך 72 h במהלך התרבות של תאים PANC-1 ו- AsPC-1. 5.0 x 105 תאים היו חורר מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום, מודגרות במשך 24 שעות ביממה, לשנות ל- pH נמוך תרבות בינוני. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. מתאם בין לקטאט או ריכוזי HCl ו- pH של המדיום. המדיום שליטה (pH 7.4) היה באגירה מלאה עם ריכוזים שונים של לקטט או HCl. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה תואר נמוך ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 היה גבוה ב PANC-1 ו- AsPC-1 תאים בהקשר של חומציות נמוכה (pH) מאשר תחת היפוקסיה (H) או תנאי רעב מזין (NS) אחרי ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה חמצת לקטית, חמצת בתיווך HCl. הביטוי של mRNAs IDI1, MSMO1ו INSIG1 ב PANC-1 תאים ותאים AsPC-1 נקבע ע י ניתוח כמותי פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת תחת שליטה (קון; pH 7.4), חומציות נמוכה (pH; pH 6.8, צמצום כמות NaHCO3 ), חמצת לקטית (חומצת החלב; pH 6.8, גדלה כמות חומצת החלב), ותנאי בתיווך HCl חמצת (HCl; pH 6.8, גדלה כמות של HCl) עבור ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה pH נמוך של תאים נורמליים. ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 upregulated ב fibroblastic ק מ- 6, טיג, תאים MRC9 ותאי אנדותל HUVEC לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. רמת ביטוי של גנים אחראים-pH חומצי בתנאי pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) לשם השוואה תחת pH נמוך (pH 6.8). רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH כמו IDI1, MSMO1ו INSIG1 נותרת ללא שינוי בתנאים pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) ב PANC-1, AsPC-1 תאים לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריימר | רצף פריימר לפנים | פריימר | רצף pimer הפוכה | ||
| ACTB | 5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3' | ACTB | 5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3' | ||
| MSMO1 | 5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3' | MSMO1 | 5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3' | ||
| INSIG1 | 5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3' | INSIG1 | 5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3' | ||
| IDI1 | 5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3' | IDI1 | 5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3' | ||
טבלה 1- רשימת תחל להשתמש בניתוח ה-PCR כמותי בזמן אמת-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזין.
המפתח של שיטה זו הוא לקבוע את המתאים ריכוזי ביקרבונט, לקטט, HCl במדיום תרבות. מדידת רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט בעת ביצוע פעולת שירות זו בפעם הראשונה חשובה לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO3 במדיום. במהלך תהליך זה, יש צורך למדוד את רמת ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, כמו טמפרטורה ומצב שיווי משקל בינוני של CO2 רבות על ה-pH בינוני. Autoclaving של ביקרבונט מומלץ לעתים קרובות, כמו ביקרבונט בקלות הופך שטוח. צפיפות תא, confluency תא הם גורמים מהותיים כי מספר גדול של תאים סרטניים גדל בקלות acidify של המדיום תרבות אפילו בדגימות שליטה. בנוסף, תגובות ה-pH חומצי חוץ-תאית תלויים התנאי של התאים, ועלול לדהות כמו תאים הם passaged, אז תאים עם פחות מ- 10 קטעים שימשו את הניסויים.
השיטה שלנו באופן משמעותי הפגינו את היציבות של pH בינונית במשך 24 שעות ביממה, לעומת מספר מדיה pH חומצי. פרוטוקול זה, שימשה pH בינונית של 6.8 כמו תנאי pH נמוך, אבל טורי pH חומצי בין pH 6.4 ו 6.9, בנוסף התקשורת הטורית pH בסיסי בין pH 7.4 ו- 8.0, שימשו כדי לחקור את תגובת תאי נגד acidification חוץ-תאית.
התמקדנו בעיקר תאים סרטניים, אך שיטה זו יכולה לשמש עבור סוגים אחרים של תאים בתוך microenvironment הגידול, לרבות תאי סטרומה תאים חיסוניים, תאי אנדותל כלי הדם. אנחנו ואחרים דיווחו כי לפחות חלק מנגנונים רגישים pH בתאים סרטניים נפוצים ב תאים נורמליים7. זה אפשרי גם ליישם שיטה זו לניתוח של ראשי תאים אחרים, כמו גם תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. מגבלה אחת של מערכת תרבות זו יכולה להיות הקושי של שמירה על התנאי pH חומצי בניסויים לטווח ארוך.
חמצת מזוהה עם סוגים שונים של מחלות. שיטה זו יכולה להיות ישים לא רק בחקר הסרטן אלא גם בלימוד הפרעות חומציים כגון חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת אבובית הכליה חמצת נשימתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר קונדו הוא עובד של Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ
Acknowledgments
אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א
Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר
מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W.
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
