Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno
Summary
Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un’ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.
Abstract
Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell’amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l’argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L’analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un’analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.
Introduction
HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l’amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.
Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contributo potenzialmente negative per valutazione di biomarcatori e trattamenti risposta4. Secondo la College di patologi americani (PAC), eterogeneità di HER2 esiste se HER2 è amplificato > 5% e < 50% di infiltrazione del tumore cellule5. Purtroppo, l’incidenza effettiva della eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno rimane un argomento di polemica tra patologi, con alcuni autori sostenendo che è un evento eccessivamente raro, e altri che suggeriscono che fino al 40% dei casi sono HER2-eterogenei1,5,6,7,8,9,10. Nonostante i meccanismi biologici che sono alla base di questa condizione non sono ancora completamente chiariti, l’impatto prognostico e clinico di eterogeneità di intra-tumore HER2 è cruciale per seno cancro pazienti11.
Recentemente, luminoso-campo tecniche molecolari, quali ISH cromogenica (CISH) e argento ISH (SISH), sono emersi come metodi affidabili per rilevare HER2 eterogeneità nei tessuti FFPE, con alcuni vantaggi rispetto al fluorescenti ISH (pesce)12. Purtroppo, l’analisi di massa di singoli casi rimane impraticabile in studi di coorte di grande ricerca. Parecchi gruppi hanno suggerito che la combinazione di istochimica, IHC e ISH con tecnologie TMA potrebbe rappresentare una strategia utile nello studio della biologia del cancro13,14,15,16. Con questo metodo ampiamente adottato, campioni di tessuto da pazienti diversi possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al minimo il tessuto e i reagenti impiegati e promuovendo così l’analisi uniforme di una grande serie di casi14. Tuttavia, nessun protocolli sono disponibile per la caratterizzazione molecolare di alto-rendimento simultanea di più campioni di tessuto che ha subito diverse elaborazione in termini di reagenti, tempi di fissazione e metodi di conservazione autonomi, tali come archivio storico blocchi.
Date le implicazioni cliniche e prognostiche di eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno, abbiamo sviluppato una piattaforma integrata molecolare per valutarlo in ampia serie di casi eterogeneo trasformati. Qui, abbiamo ritrarre le strategie di laboratorio per generare e analizzare l’eterogeneità intra-tumorale di amplificazione di HER2 in high yield TMAs di cancro al seno per mezzo di SISH. Il seguente protocollo è stato sviluppato per i tumori di misura > 5 mm (> pT1b secondo il TNM 2017)17. Per le più piccole lesioni, si consiglia di eseguire l’analisi su sezioni di serie integrale. La nostra procedura consente l’analisi simultanea di IHC e SISH di fino a 30 cancri al seno, che comprende una media di 6 zone distinte (gamma 4-8) per ciascun caso. Complessivamente, 180 nuclei di tessuto di 1 mm di diametro, con 500 µm tra il core e 2 mm tra la griglia e bordi verranno generati per ogni blocco TMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell’eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.
Data l’importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
Riferimenti
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