HER2 Gene amplifikasyon meme kanserleri heterojen değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tarama Platform kurma
Summary
Türdeş olmayan dağıtım HER2-pozitif hücrelerinin meme kanserlerinin bir alt kümede görülebilir ve klinik ikilemler oluşturur. Burada, tanımlamak, ölçmek ve HER2 içi tümör genetik heterojenite heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin büyük bir dizi karşılaştırmak için güvenilir ve düşük maliyetli bir iletişim kuralı tanıtmak.
Abstract
İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) karşı hedefli tedaviler HER2-pozitif meme kanseri olan hastalarda, sonucunu kökten değişti. Ancak, bir azınlık olguların önemli klinik sorunlar oluşturan heterojen bir dağıtım HER2-pozitif hücrelerinin görüntüler. Bugüne kadar hiçbir güvenilir ve standart protokolleri karakterizasyonu ve miktar ile HER2 heterojen gene amplifikasyon içinde büyük tabur için önerilmiştir. Burada, aynı anda birden fazla meme kanserlerinin farklı topografik alanları arasında HER2 durumu değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek metodoloji mevcut. Özellikle, tümörler hedef eşlemesi ekleme gelişmiş doku microarrays (ayarlayınca) oluşturmak için laboratuvar yordamı göstermektedir. Tüm TMA parametreleri özellikle gümüş in situ hibridizasyon (FFPE) meme dokuları parafin gömülü formalin sabit için (SISH) optimize edilmiştir. Prognostik ve akıllı biyolojik (Yani, ER, halkla ilişkiler, Ki67 ve HER2) analizini immunohistokimyasal otomatik yordamları kullanarak yapılmalıdır. Özelleştirilmiş bir SISH protokol farklı fiksasyon, işleme ve depolama yordamlar yapılan birden fazla doku arasında bir yüksek kaliteli moleküler analiz izin vermek için uygulamaya konmuştur. Bu çalışmada, biz bir kanıt-in-belirli DNA dizileri verimli ve düşük maliyetli bir yöntem kullanarak aynı anda birden çok farklı topografik alanlarında yerelleştirilmiş ve heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin olabilir ilke sağlar.
Introduction
HER2 overexpressed ve tüm invaziv meme kanserleri1,%215-30’güçlendirilmiş bir proto-oncogene var. HER2 overexpression varlığı ile değişkenden > % 10 hücrelerle gene amplifikasyon zaman HER2/şeması oranı ≥2 ya Gen kopya sayısı ≥6, tespit edilebilir iken boyama (3 +), sayma güçlü membran immunohistokimyasal (IHC) En azından 20 hücreleri tarafından in situ hibridizasyon (ISH)3.
İçi tümör genetik heterojenite, meme kanserleri, biyolojik değerlendirme ve tedavi yanıt4potansiyel olumsuz bir katılımcı olmak yaygın olarak tanımlanmıştır. HER2 içinde güçlendirilmiş College of Amerikan patologlar (kap göre), HER2 heterojenite var demektir > % 5 ve < %50-in tümör infiltre hücreleri5. Ne yazık ki, meme kanserleri HER2 kayma heterojenite gerçek insidansı bir konu tartışma patologlar arasında kalır, bazı yazarlar bu bakımı ile son derece nadir bir olaydır ve diğerleri olguların % 40 ilâ ima HER2-heterojen1,5,6,7,8,9,10. Bu durum temelini oluşturan biyolojik mekanizmaları rağmen değil henüz tam olarak, içi tümör HER2 heterojenite prognostik ve klinik etkileri meme kanseri hastaların11için önemlidir açıkladı.
Son zamanlarda, chromogenic ISH (CISH) ve gümüş ISH (SISH), gibi parlak alan moleküler teknikleri floresan ISH (balık)12‘ ye göre bazı avantajları ile FFPE dokularda HER2 heterojenite algılamak için güvenilir yöntemi olarak ortaya çıkmıştır. Ne yazık ki, toplu analiz tek olguların büyük kohort araştırma çalışmaları içinde pratik kalır. Çeşitli gruplar histochemistry, IHC ve ISH TMA teknolojileri kombinasyonu çalışmada kanser Biyoloji13,14,15,16, değerli bir strateji doğurabilecek tavsiye ettiler. Bu yaygın olarak kabul edilen yöntemle doku örnekleri farklı hastalarda aynı anda, doku ve istihdam ve böylece durumlarda14büyük bir dizi tek tip analizi teşvik reaktifler minimize analiz edilebilir. Ancak, iletişim kuralı yok eşzamanlı yüksek üretilen iş moleküler karakterizasyonu farklı olarak arşivleme işleme reaktifler, fiksasyon kez ve koruma yöntemleri istihdam, böyle açısından uygulanan birden fazla doku örnekleri için kullanılabilir. blok.
HER2 kayma heterojenite prognostik ve klinik etkileri meme kanserlerinin göz önüne alındığında, biz heterogeneously işlenmiş durumda büyük dizi değerlendirmek için entegre bir moleküler platform geliştirilmiştir. Burada, biz üretmek ve yüksek verimli ayarlayınca içinde HER2 amplifikasyon meme kanseri içi tümör heterojen SISH aracılığıyla analiz laboratuvar stratejileri tasvir. Aşağıdaki iletişim kuralı ölçme tümörler için geliştirilen > 5 mm (> pT1b göre TNM 2017)17. Daha küçük lezyonlar için tam yüz seri bölümlerde çözümlemesini öneririz. Prosedürü her servis talebi için 6 farklı alanlara (aralığı 4-8) ortalaması kapsayan 30 meme kanserlerinin eşzamanlı IHC ve SISH analizi için izin verir. Özet olarak, 1 mm çapında, çekirdek ve kılavuz ve kenarları arasında 2 mm arasında 500 µm ile 180 doku çekirdek her TMA bloğu için oluşturulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, SISH çözümlemesi HER2 gen ve onun karşılık gelen şeması içinde heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin yüksek verimli ayarlayınca yapma laboratuvar stratejileri ayrıntılı olması. Bu yöntem düşük maliyetli ve HER2 gene amplifikasyon heterojenite büyük tabur meme kanserleri alındı formu patoloji arşivlerin incelenmesi için çoğu laboratuarlarında yürütülen olabilir.
Meme kanseri ve türdeş olmayan ifade tarafından oluşturulan zorlu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
Riferimenti
- Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
- Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
- Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
- Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
- Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
- Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
- Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
- Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
- Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
- Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
- Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
- Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
- Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
- Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
- Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
- Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
- Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
- Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
- Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
- Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
- Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
- Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
- De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).
