Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Abstract

Beim Menschen sind Chromosom Abtrennung Fehler in Eizellen verantwortlich für die meisten Fehlschläge und Geburtsschäden. Außerdem ist, wie Frauen im Alter, ist ihr Risiko zu konzipieren, dass eine Aneuploidie Fötus drastisch erhöht und dieses Phänomen als mütterliches Alter-Effekt bekannt. Eine Voraussetzung für präzise Chromosom Trennung während der meiotischen Divisionen sind Wartung der Schwester Chromatids Zusammenhalt in der erweiterten Prophase-Zeit, die Eizellen zu erleben. Zytologische Nachweis bei Menschen und Modellorganismen zufolge meiotische Zusammenhalt während der Alterungsprozess verschlechtert sich. Darüber hinaus Segregation Fehler in der menschlichen Eizellen sind am häufigsten während der Meiose I, Einklang mit vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt. Die Verwendung von Modellorganismen ist entscheidend für die Entschlüsselung der Mechanismen, die altersabhängigen Verlust der Kohäsion zugrunde liegen. Drosophila Melanogaster bietet mehrere Vorteile für die Regulierung der meiotischen Zusammenhalt in Eizellen zu studieren. Allerdings waren bis vor kurzem nur genetische Tests zur Verfügung, um für den Verlust von Arm Zusammenhalt in Eizellen von unterschiedlichen Genotypen oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen bestimmen. Hier ist ein detailliertes Protokoll, unter der Voraussetzung für die Verwendung von Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) direkt zu visualisieren Mängel an Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen verhaftet. Erzeugen eine Fisch-Sonde, die am distalen Arm des x-Chromosoms hybridisiert und konfokale Z-Stapel zu sammeln, kann Forscher die Anzahl der einzelnen Fische Signale in drei Dimensionen zu visualisieren und festzustellen, ob Schwester Chromatids Arme sind getrennt. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, Arm Zusammenhalt Mängel in Hunderten von Drosophila Eizellen zu quantifizieren. Als solches stellt diese Methode ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die zum Zusammenhalt Wartung sowie die Faktoren, die zu seinem Untergang, während der Alterungsprozess führen beitragen.

Introduction

Angemessene Trennung der Chromosomen während der Mitose und Meiose erfordert, dass Schwester Chromatids Zusammenhalt werden eingerichtet, gepflegt und veröffentlicht in koordinierter Form1,2. Zusammenhalt ist in S Phase etabliert und wird durch die Cohesin komplexe, die physischen Verbindungen bildet, die die Schwester halten vermittelt Chromatiden zusammen. In Meiose, Zusammenhalt distal zu einer Überschneidung auch Funktionen zum rekombinanten homologe zusammen zu halten und diese körperliche Vereinigung gewährleistet korrekte Ausrichtung der Bivalent auf der Metaphase ich Spindel (Abbildung 1)3,4, 5. Freisetzung von Arm Zusammenhalt auf Anaphase ich ermöglicht die homologe zu den entgegengesetzten Polen der Spindel zu trennen. Jedoch wenn Arm Zusammenhalt ist verloren vorzeitig, rekombinante homologe verlieren ihre physische Verbindung und zufällig, zu trennen, was aneuploiden Keimzellen (Abbildung 1) führen kann.

In der menschlichen Eizellen Fehler im Chromosom Trennung sind die häufigste Ursache für Fehlschläge und Geburtsschäden, wie z. B. Down-Syndrom-6, und ihre Häufigkeit steigt exponentiell mit der mütterlichen Alter7. Schwester Chromatids Zusammenhalt entsteht in der fetalen Eizellen und meiotischen Rekombination erfolgt vor der Geburt. Eizellen dann verhaften in Mitte Prophase ich bis zum Eisprung und während dieser Festnahme, die weiterhin körperliche Vereinigung der rekombinanten homologe setzt auf Schwester Chromatids Zusammenhalt. Daher genaue Trennung während der Meiose und normale Schwangerschaft Ergebnisse erfordern, dass Zusammenhalt für bis zu fünf Jahrzehnte intakt bleiben.

Vorzeitiger Verlust der Zusammenhalt während der verlängerten meiotische Festnahme von menschlichen Eizellen zu der mütterlichen Alter Wirkung beitragen soll und mehrere Textzeilen Beweise unterstützen diese Hypothese8,9. Jedoch angesichts der Herausforderungen des Studiums meiotische Zusammenhalt in der menschlichen Eizellen, viel von unserem Verständnis für dieses Phänomen beruht auf der Verwendung von Modell Organismen5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila Melanogaster Eizellen bieten zahlreiche Vorteile für die Studie der meiotischen Zusammenhalt und Chromosom Segregation. Eine einfache genetische Test erlaubt es, Nachkommen von aneuploiden Keimzellen erholen und messen die Treue des X-Chromosom Segregation auf einer großen Skala11,16,17. Darüber hinaus kann man auch bestimmen, ob Chromosom Abtrennung Fehler entstehen, weil rekombinante homologe missegregate während der Meiose I, einem Phänotyp, der vorzeitige Verlust der Arm Zusammenhalt11,18, entspricht 19. direkte Beobachtung des Bundesstaates meiotische Zusammenhalt in Drosophila Eizellen ist auch möglich mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH). Obwohl fluoreszierende Oligonukleotiden, die sich wiederholende Sat-Sequenzen hybridisieren wurden für mehr als ein Jahrzehnt zur Chromosomenregion Zusammenhalt in Reife Drosophila Eizellen4,20, Analyse der Arm überwachen Zusammenhalt ist viel schwieriger gewesen. Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt erfordert eine Sonde, die ein großes Gebiet der Urschrift umfasst Sequenzen und ist hell genug, um sichtbare Signale für einzelne Schwester Chromatiden entstehen, wenn Arm Zusammenhalt fehlt. Darüber hinaus müssen die Eizelle Fixierung Bedingungen und Größe der beschrifteten DNA eindringen21 in der großen Reifen Drosophila Eizelle (200 µm Breite von 500 µm lang) erleichtern. Vor kurzem wurde eine Arm-Sonde erfolgreich genutzt, Drosophila Eizelle Chromatiden während Anaphase zu visualisieren, ich, aber die Autoren erklärt, dass sie nicht ein Signal im prometaphase erkennen könnte oder Metaphase ich verhaftet Eizellen22. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Generation von X-Chromosom Arm FISH-Sonden und Eizelle Herstellungsbedingungen, die uns für den vorzeitigen Verlust der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase assay ich und Metaphase erlaubt haben, ich Eizellen. Diese Techniken, die es uns ermöglicht haben, Genprodukte zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der meiotischen Zusammenhalt erforderlich sind, damit andere assay für Schwester Chromatids Zusammenhalt Mängel an Reifen Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vorbereitungen

  1. Erarbeiten Sie Lösungen für die Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH). Bereiten Sie alle Lösungen mit Reinstwasser.
    1. 5 x geändert Robb Puffer vorzubereiten: 275 mM Kalium Acetat, 200 mM Natriumacetat, 500 mM Saccharose, 50 mM Glucose, Magnesiumchlorid 6 mM, 5 mM-Kalzium-Chlorid, 500 mM HEPES pH = 7.4. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 10 N NaOH. Filter zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C. Tauen Sie auf und auf 1 X zu verdünnen Sie, je nach Bedarf und speichern Sie 1 X Aliquote bei-20 ° C.
    2. Bereiten Sie 10 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1,3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4 vor. Bringen Sie pH 7,0 mit 10 N NaOH. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren oder Filter sterilisieren.
  2. Poly-L-Lysin Deckgläsern eines Tages vorzubereiten bevor benötigt.
    1. 70 % Ethanol enthält 1 % iger Salzsäure auf die Oberfläche einer 18 x 18 mm #1.5-Deckglas Pipette und inkubieren Sie 5 min. Einsatz Vakuum Aspiration, Flüssigkeit zu entfernen. Wiederholen Sie mit sterilen Reinstwasser. Oberfläche des Deckglases mit 0,1 mg/mL Poly-L-Lysin abdecken und 10 min inkubieren.
    2. Aspirieren Sie um Flüssigkeit zu entfernen und an der Luft trocknen für 10 min. Store Deckgläsern Poly-L-Lysin Seite nach oben in einen Kunststoffbehälter mit einem dicht schließenden Deckel, Staub zu vermeiden.
  3. Bereiten Sie zog Pasteur Pipetten, flüssige Lösungen entfernen, ohne die Eizellen. Erhitzen Sie über einen Bunsenbrenner-Flamme die Mitte eines langen Glas Pasteurpipette vorsichtig an beiden Enden ziehen, bis das Glas schmilzt und auseinander zieht.

2. Generation des Arm-Sonde für Fisch

Hinweis: Alle Zentrifuge Schritte sind bei ~ 16.000-21.000 x g (Höchstgeschwindigkeit auf den meisten Tischplatte Tischzentrifugen) durchgeführt. Kurze Zentrifuge Drehungen zeigen Spinnerei für 5-15 S. Vortex vortexen für ~ 15 gibt s bei max. Geschwindigkeit, sofern nicht anders angegeben.

Hinweis: BACs für Arm-Sonden erhalten Sie bei BAC PAC Ressourcen. Zwei X Chromosom euchromatisch Arm Sonden wurden mit dieser Methode erfolgreich eingesetzt. Ein Arm-Sonde wurde komponiert von sechs BAC Klone entsprechend zu zytologischen bands 6E-7 b (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Die andere Arm-Sonde bestand aus sechs BAC Klone, zytologische Bands 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13) entspricht. BACs zu anderen Drosophila -Chromosom Regionen können durchsucht werden, an: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Zwei Pericentric-Sonden, die die 359 bp Sat-Wiederholung des x-Chromosoms erkannt wurden mit dieser Methode erfolgreich eingesetzt. Eine 22 Nukleotid-Sonde wurde ausgiebig verwendet und funktioniert gut (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Eine 28 Nukleotid-Sonde wurde vor kurzem getestet und auch gut funktioniert (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC gereinigt Oligonukleotide, die bestellt wurden 5' mit einem bestimmten Fluorophore beschriftet aus kommerziellen Quellen (z. B.integrierte DNA-Technologien).

  1. Prep BAC Klon DNA Kit Anweisungen wie in der Tabelle der Materialienangegeben. Aufschwemmen Sie das DNA-Pellet aus 100 mL der Kultur in 200 µL TE gewonnen; die Endkonzentration DNA sollte zwischen 5-40 ng/µL abhängig von der BAC-Klon liegen.
  2. Führen Sie DNA Verstärkung für jeden BAC mit dem Verstärker Kit, wie in der Tabelle der Materialien und das folgende Protokoll angegeben. BAC DNA individuell für jeden Klon zu verarbeiten. Verwenden Sie Enzyme und Puffer mit dem Kit in Schritten 2.2.1 bis 2.2.3 geliefert.
    1. Zufälligen Fragmentierung der BAC-DNA: für jede BAC verwenden TE 10 µL einer 1 ng/µL DNA-Lösung in einem 200 µL PCR Rohr vorzubereiten. Fügen Sie 1 µL 10 X Fragmentierung Puffer. Legen Sie dem Rohr in einer PCR-Maschine bei 95 ° C für genau 4 min. sofort kühlen die Probe in Eiswasser und Zentrifugieren Sie kurz. Die Inkubationszeit ist zeitkritisch und jede Abweichung kann Ergebnisse verändern.
    2. Bibliothek-Vorbereitung
      Hinweis: Diese Methode verwendet zufällige Primer, um eine Bibliothek von amplifiable Fragmenten zu generieren.
      1. Die Röhre, die die DNA enthält fügen Sie die folgenden: 2 µL 1 x Bibliothek Vorbereitung Puffer, 1 µL Bibliothek Stabilisierung Lösung. Durch Vortexen mischen Sie gründlich, Zentrifugieren Sie kurz, und legen Sie dem Rohr in der PCR-Maschine bei 95 ° C für 2 min. sofort kühlen die Probe in Eiswasser und Zentrifugieren Sie kurz.
      2. Fügen Sie 1 µL Bibliothek Vorbereitung Enzym zum PCR-Röhrchen, Mischung und Zentrifuge kurz. Ort-PCR in der PCR-Maschine Rohr und inkubieren Sie wie folgt: 16 ° C für 20 min, 24 ° C für 20 min, 37 ° C für 20 min, 75 ° C für 5 min, dann halten Sie bei 4 ° C.
      3. Proben aus dem PCR-Gerät entfernen und kurz zentrifugieren. Proben können sofort verstärkt oder bei-20 ° C bis zu drei Tage lang gespeichert.
    3. Verstärkung des BAC DNA-Bibliothek
      1. Hinzufügen der folgenden Reagenzien, die gesamten 15 µL zufällige Fragment Reaktion: 7,5 µL 10 x Verstärkung Master Mix, 47,5 µL Nuklease Freiwasser, 5 µL WGA-DNA-Polymerase. Durch Vortexen gründlich mischen und kurz zentrifugieren.
      2. Ort-PCR in der PCR-Maschine Rohr und inkubieren Sie wie folgt: erste Denaturierung 95 ° C für 3 min, 14 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 15 s, gefolgt von Glühen/Verlängerung bei 65 ° C für 5 min, dann halten Sie bei 4 ° c
      3. Nachdem Radfahren abgeschlossen ist, überprüfen Sie die DNA-Konzentration. Die Konzentration von DNA sollte mindestens 800 ng / µL. halten Sie Proben bei 4 ° C oder Store bei-20 ° C bis bereit für die Verdauung. Optional, bewerten DNA Fragmentgröße durch Ausführen von 400 ng DNA auf einem 2 % Agarosegel. Fragmente sollten reichen von 200 bp auf 3 kb (Abbildung 2).
  3. Beschränkung Enzym Verdauung der amplifizierten DNA
    1. Platz 20 µg der amplifizierten DNA aus dem vorherigen Abschnitt in einem 1,5 mL Microfuge Rohr. Hinzufügen von 20 Einheiten der Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 Einheiten von BfuCl, 0,5 µL 100 X BSA, 5 µL 10 x Beschränkung Enzym Verdauung Puffer, und stellen Sie die Lautstärke auf 50 µL indem man die entsprechende Menge an hochreinen H2O.
    2. Inkubieren Sie die Übersicht über Nacht bei 37 ° C im Brutschrank, Kondenswasser auf dem Deckel zu verhindern. Ethanol überstürzen sich die verdaute DNA. Hinzufügen der Digest: 1 µL Glykogen, 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, 2,5 Bände molekularen Klasse 100 % Ethanol. Inkubation bei-80 ° C für 1 Stunde oder über Nacht.
    3. Zentrifuge für 30 min bei 4 ° C. Waschen Sie DNA-Pellet mit 1 Volumen von Raum temp 70 % Ethanol und Spin für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen und die DNA pellet lufttrocknen oder sanft mit einem stetigen Strom von Luft trocknen zu lassen.
    4. Das DNA-Pellet in 36 µL steriler ultrapure H2O Aufschwemmen und 1 µL DNA verwenden, um die DNA-Konzentration assay, ca. 285 müsste ng / µL. speichern Sie die DNA bei-20 ° C.
    5. Optional bewerten DNA Fragmentgröße laufen 400 ng DNA auf einem 2 % Agarosegel. Die meisten Fragmente sollten reichen von 100-200 bp, mit einem schwächeren Signal bis zu 500 bp (Abbildung 2).
  4. 3' tailing Reaktion
    1. Denaturieren Sie die verdaute DNA bei 100 ° C für 1 min in einem Heizblock. Sofort im Eiswasser abkühlen lassen. Fügen Sie folgenden Code an die 35 µL DNA: 50 µL 400 mM Natrium Cacodylate, 1 µL 10 mM DTT und Vortex gut. Fügen Sie 4 µL 25 mM CoCl2, 2,5 µL 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP von ARES labeling Kit wie angegeben in der Tabelle der Materialien, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL 5 X TdT Puffer und 1 µL terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) 400 U / µL. Vortex und Zentrifuge kurz.
      Achtung: CoCl2 ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
    2. Inkubieren Sie für 2 h bei 37 ° C im Brutschrank um Kondensation zu verhindern. Fügen Sie 1 µL 250 mM EDTA, die Reaktion und Vortex kurz zu mischen zu stoppen. Ethanol ausgefällt tailed DNA wie oben (Schritte 2.3.2 - 2.3.4) beschrieben. Aufschwemmen Sie getrocknete DNA-Pellet in 10 µL steriler ultrapure H2O. Store die DNA bei-20 ° C bis bereit zu fahren.
  5. Durchzuführen Sie Fluoreszenzfarbstoff Konjugation mit dem DNA-Kennzeichnung gemäß der Materialtabelle.
    Hinweis: Nachdem Sie Farbstoff hinzugefügt halten Sie Proben im Dunkeln.
    1. Denaturieren Sie die tailed DNA bei 95 ° C für 5 min in einem Heizblock. Sofort DNA in Eiswasser und Zentrifuge kurz abkühlen. Bereiten Sie Kennzeichnung Puffer entsprechend den Anweisungen des Kit und jede DNA-Probe fügen Sie 6 µL hinzu. Jedes Rohr des Farbstoffes in 4 µL von DMSO aus dem Kit aufzuwirbeln. Wirbel und Zentrifuge kurz.
    2. Verwenden Sie eine Tube Farbstoff für jede Kennzeichnung Reaktion. Hinzu kommen die Farbstofflösung der DNA, Wirbel und Zentrifuge kurz. Inkubieren Sie die Kennzeichnung Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln. Fügen Sie 3 µL 3M Hydroxylamin zu stoppen die Reaktion gefolgt von 77 µL der Nuklease-frei H2O aus dem Kit. Wirbel und Zentrifuge kurz.
  6. Nicht konjugiert Farbstoff mit dem PCR-Reinigung-Kit wie angegeben in der Tabelle der Materialien zu entfernen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Eluieren Sie DNA aus der Spalte, die zwei Mal mit 40 µL Elution Puffer jeweils.
  7. Ethanol-Niederschlag der beschrifteten DNA wie zuvor beschrieben (Schritte 2.3.2 - 2.3.4). Das getrocknete DNA-Pellet in 10 µL Elution Puffer aufzuwirbeln.
  8. Bereiten Sie Sonde Mischung
    1. Bestimmen Sie für beschrifteten DNA die Konzentration des Farbstoffs Fluorochrom in Pmol/µL. Die Fluorophor Konzentration reichen von 30-100 Pmol/µL, abhängig von der BAC. Die DNA-Konzentration reichen von 300-800 ng/µL.
      Hinweis: Die Microarray-Einstellung funktioniert gut auf einem Microvolume Spektralphotometer, wie Sie in der Tabelle der Materialien angegeben. Die Microarray-Fenster wählen Sie DNA-50, und geben Sie die Fluorochrom.
    2. Erstellen Sie einen master-Mix durch die Kombination von äquimolaren Mengen (Pmol Fluor) von jedem der BAC-Sonden. Vortex 30 s vor kombinieren. Zur Vermeidung von Frost/Tau-Wechseln bereiten Sie Aliquote des master Mix, tragen Sie Paraffin Schicht auf, an den Rohren um Verdunstung zu verhindern, und speichern Sie im Dunkeln bei-20 ° C.
      Hinweis: Ein Mastermix mit 250 Pmol jedes der 6 einzelnen BAC Sonden in einem Gesamtvolumen von 30-50 µL funktioniert gut. Eine aliquote mit 25 Pmol (Fluor) für jede BAC wird für zwei 40 µL Hybridisierung Reaktionen, mit einer endgültigen Sonde Konzentration von 0,31 Fluor Pmol/µL für jedes BAC ausreichen.

(3) sezieren und Fixierung der Eizellen

  1. Sammle 30 jungfräuliche Weibchen von der entsprechenden Genotyp. Späten Stadium Eizellen zu bereichern, halten Sie Frauen ohne Männer in ein Fläschchen mit fliegen Essen und Trockenhefe für 3-5 Tage vor Dissektion25. Übertragen Sie am Vortag Dissektion, die Weibchen ohne Gas zu einem frischen Fläschchen mit Hefe.
  2. Führen Sie die Dissektion.
    Hinweis: Siehe Abbildung 3 für Werkzeuge benötigt. Lösungen werden entfernt mit einer gezogenen Pasteurpipette, sofern nicht anders angegeben. Bei der Eierstöcke immer Übertragung verwenden einer Pipettenspitze mit 10 % BSA Lösung beschichtet.
    1. Verwenden Sie in eine flache sezierenden Schüssel mit geändert Robb Puffer Zange, um ein einzelnes Weibchen die Eierstöcke entfernt. Verwendung einer Pinzette oder einer Wolfram-Nadel zu jedem Eierstock, so dass die Lösung innere Ovariolen kontaktieren vorsichtig spreizen. Übertragen Sie das Paar der gespreizten Eierstöcke auf eine 1,5 mL-Microfuge-Röhrchen mit 1 mL geändert Robb Puffer.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.2.1 Eierstöcke von 20-25 Frauen in der 1,5 mL Microfuge Tube ansammeln. Dissektionen der 20-25 Weibchen innerhalb von 10 min zu beenden.
  3. Führen Sie folgendermaßen Fixierung.
    1. Entfernen Sie mit einer gezogenen Pasteurpipette die Flüssigkeit in der Röhre Microfuge, verwenden ein P1000 die Eierstöcke schnell 500 µL 37 ° C-Fix-Lösung hinzu und dann sofort hinzufügen 500 µL Raumtemperatur Heptan die Eierstöcke.
    2. Shake Microfuge Rohr zu mischen und auf ein Nutator für 3 min. entfernen das Microfuge Rohr aus der Nutator und in einem Rohr Rack für 1 min um die Eizellen zu ermöglichen, sich auf den Boden. Es ist 4 min. totale Fixierung.
      Vorsicht: Lösung und Heptan sind giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
    3. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Eierstöcke 3mal in 500 µL PBS mit 0,5 % BSA und 0,1 % Triton x-100 (PBSBTx)
  4. Wiederholen Sie für verbleibende Genotypen.

4. Entfernung des Chorions und Dotterhäutchen Membranen

Hinweis: Siehe Abbildung 3 für Werkzeuge benötigt.

  1. Separate späten Stadium Eizellen
    1. Eine flache sezierenden Schüssel 1 mL PBSBTx hinzufügen. Verwenden Sie ein P200 mit BSA beschichtete Spitze feste Eierstöcke (bei ~ 150 µL) in die flachen Teller zu übertragen. Pipette Eierstöcke rauf und runter mit der BSA beschichtete Pipettenspitze, die reifen Eizellen von weniger reifen Eizellen zu verdrängen.
    2. Beim späten Stadium Eizellen ausreichend voneinander getrennt sind, übertragen Sie das Gewebe auf ein 500 µL Microfuge Rohr. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem gezogenen Pasteurpipette, verlassen über 150-200 µL in der Röhre. Abschnitt 4.1 für die übrigen Genotypen zu wiederholen.
  2. Vorbereiten der Rollen
    1. Ein Tiefbrunnen Gericht mit 200 µL PBSBTx. Cover Vornässen und beiseite stellen. Erhalten Sie 3 Milchglas Rutschen und Set Folie #3 beiseite. Reiben Sie die Milchglas-Regionen von Dias #1 und #2 zusammen. Spülen Sie sie in entionisiertem Wasser Glasscherben entfernen und trocknen mit einem Einweg-abwischen.
    2. Mantel die mattierten Regionen der Folien #1 und #2 mit PBSBTx von 50 µL des PBSBTx zu einer Folie hinzufügen und reiben diese Region mit der anderen Folie. Entfernen Sie Flüssigkeit mit einem Einweg-Tuch.
    3. Legen Sie die Folien unter dem sezierenden Mikroskop in die Konfiguration in Abbildung 4Agezeigt. Halten Sie die mattierten Regionen von Dias #1 und #2 in Kontakt, mit Folie #3 Folie #2 unterstützt.
  3. Roll Eizellen; sicherzustellen Sie, dass die Richtung des Rollens immer in einer geraden Linie und nie eine Kreisbewegung.
    1. Prewet ein P200 Pipette Tipp im PBSBTx und verteilen die Eizellen in der Microfuge Röhre durch Pipettieren rauf und runter. Übertragen Sie 50 µL Flüssigkeit enthaltenden Eizellen auf der Mitte des Teils Milchglas Folie #1. Heben Sie die Folie #2, dies zu tun.
    2. Senken Sie langsam Folie #2, bis die Oberflächenspannung der Flüssigkeit eine Dichtung zwischen den beiden Milchglas Regionen erstellt. Es sollte genügend Flüssigkeit auf der mattierten Fläche aber keiner heraus sickert werden sollte. Wenn Flüssigkeit überläuft, verwenden Sie ein gezogenes Pasteurpipette, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    3. Die untere Folie (#1) mit einer Hand festhalten und andererseits der Oberschlitten (#2) hin und her verschieben in horizontaler Richtung, halten Folienebene #2 und unterstützten auf Folie #3 zu verwenden. Führen Sie unter dem Mikroskop für einfache Visualisierung der Bewegungen der Eizelle und des Fortschritts.
      Hinweis: Diese Bewegung erzeugt Reibung und dazu führen, dass die Eizellen zu "Rollen" und verlieren ihre Chorions. Minimaler Druck verwendet werden sollte und Bewegungen sollte kurz und schnell.
    4. Nach ein paar Bewegungen in horizontaler Richtung ändern Sie leicht den Winkel der Bewegung (Abbildung 4 b). Erhöhen Sie in mehreren Schritten allmählich, dieser Winkel 90° bis Bewegung der Oberschlitten (#2) senkrecht zu der Startrichtung (Abbildung 4 b). Beachten Sie, dass leere Chorions werden sichtbar in der Flüssigkeit und Eizellen fehlen Chorions länger und dünner erscheint.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.3 - 4.3.4 ca. 7-10 Mal bis die Lösung leicht trübe wird. Stoppen Sie, Rollen, wenn die Mehrheit der Eizellen (75-85 %) scheinen, ihre Dotterhäutchen Membranen verloren haben.
      Hinweis: Eine markante Spitze Ende ist häufig Eizellen fehlen Dotterhäutchen Membranen sichtbar. Dotterhäutchen Membranen sind schwieriger zu entfernen als Chorions. Leichter Druck kann auf die obere Folie (Folie #2) angewendet werden, beim Rollen zur Entfernung von Dotterhäutchen Membranen zu erreichen. Versucht, Dotterhäutchen Membranen aus allen die Eizellen führt oft zur Zerstörung des anderen Eizellen zu entfernen.
    6. Heben Sie vorsichtig die obere Folie (#2), einer der Ecken in die Mitte der Matte Region der unteren Folie (#1) ziehen, so dass Eizellen rollte in der Mitte der Matte Region sammeln. Spülen Sie Eizellen aus beiden Folien mit PBSBTx in den tiefen Brunnen Schale mit PBSBTx.
    7. Saubere Folien #1 und #2 mit Reinstwasser, trocken mit einem Einweg-abwischen und zurückgesetzt. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 - 4.3.6 bis alle Eizellen des gleichen Genotyps gerollt worden. Dies erfordert in der Regel 3-4 Runden Rollen pro Genotyp.
  4. Entfernen Sie Fremdkörper nach dem Walzen
    1. Eine 15 mL konische Rohr 1 mL PBSBTx hinzufügen. Rühren Sie die Flüssigkeit um die Seiten des Rohres zu beschichten.
    2. Mit einer PBSBTx beschichtet P1000 Pipettenspitze, Transfer die gerollten Eizellen aus der Tiefe gut austeilen, die konischen Röhrchen mit 1 mL PBSBTx. Hinzufügen einer zusätzlichen 2 mL PBSBTx mit dem konischen Rohr, die die Eizellen enthalten.
    3. Lassen Sie die Eizellen beginnen, machen Sie es sich unten, dann oben 2 mL der Lösung mit Schutt (Chorions, Vitellines, etc.) mit einem P1000 entfernen und entsorgen. Bei Bedarf halten Sie das konische Rohr vor einem dunklen Hintergrund, die undurchsichtigen Eizellen zu sehen, wie sie sinken.
    4. Die Eizellen eine zusätzliche 2 mL des PBSBTx hinzu, und wiederholen Sie Schritt 4.4.3. 4.4.3 zu wiederholen. für insgesamt 3 Runden der Schmutzentfernung.
    5. Mit einer PBSBTx beschichtet P1000 Pipettenspitze, Transfer Eizellen zurück zu der ursprünglichen 500 µL Microfuge Röhre. 20 - 25 Frauen sollten etwa 50 µL gerollte reifen Eizellen ergeben.
  5. Wiederholen Sie Abschnitt 4 für die übrigen Genotypen mit frischen mattierte Folien, ein sauber Tiefbrunnen Gericht und eine neue konische Röhre für jede Genotyp.
  6. Wenn Lagerung notwendig ist, übertragen Eizellen, 1 X PBS mit 0,1 % TritionX-100 und laden über Nacht bei 4 ° C. Langfristiger Lagerung wird nicht empfohlen, da Formaldehyd Vernetzung von nichtionischen Detergentien rückgängig gemacht werden kann.

(5) FISCH

Hinweis: Alle Waschungen sind auf eine Nutator bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Eizellen, die gerollt worden dauern länger, bis auf den Grund des Microfuge Rohres, vor allem in Lösungen zufrieden geben, die Formamid enthalten. Es ist wichtig, geduldig zu sein, wenn Lösungen zu ändern, so dass Eizellen dabei nicht verloren sind. Dies erfordert möglicherweise warten 5-15 min, Eizellen nach Spülungen und Waschungen zu begleichen zu lassen. Beachten Sie auch, dass Eizellen in Formamid deckend sind.

  1. Extraktion und RNAse-Behandlung
    1. Spülen Sie Eizellen mit 500 µL PBS mit 1 % Triton x-100 (PBSTx). Die Flüssigkeit zu entfernen und Hinzufügen von 500 µL Extraktionspuffer (PBSTx mit RNAse). Auf Nutator bei 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Pre-Hybridisierung Wäschen
    1. Spülen Sie Eizellen 3 Mal mit 500 µL 2 x Kochsalzlösung Natriumcitrat mit Tween 20 (SSCT). Eine aliquote (~ 500 µL/Genotyp) 2 x SSCT + 50 % Formamid auf 37 ° c vorheizen
      Vorsicht: Formamid ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
    2. Waschen Sie Eizellen 3 Mal für 10 min in 500 µL 2 X SSCT. Waschen Sie Eizellen für 10 min in 500 µL 2 x SSCT + 20 % Formamid. Waschen Sie Eizellen für 10 min in 500 µL 2 x SSCT + 40 % Formamid. Waschen Sie Eizellen für 10 min in 500 µL 2 x SSCT + 50 % Formamid.
    3. Entfernen Sie Flüssigkeit zu und fügen Sie 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50 % Formamid aus Schritt 5.2.1 zu probieren und inkubieren Sie für 2 h bei 37 ° C mit Rotation.
      Hinweis: Ein Hybridisierung Ofen ausgestattet mit einem Rotator funktioniert gut für diese. Ein Schaum Microfuge Rohr "schweben" an den Rotator befestigt kann verwendet werden, um die Rohre zu sichern.
  3. Denaturierung und Hybridisierung
    1. Verwenden Sie für jedes Rohr von Eizellen 40 µL 1 X Hybridisierung Puffer mit 2,5 ng/µL Zentromer Sonde und 0,31 Fluor Pmol/µL jeder BAC-Sonde. Bereiten Sie eine Lösung der Sonde im Hybridisierung Puffer ausreichend für alle Genotypen. Vortex-Sonde Mischung 30 s vor dem hinzufügen.
    2. Mit einer Pipettenspitze BSA-beschichtete P200 übertragen Sie Eizellen zu einem 200 µL PCR-Schlauch. Halten Sie Proben bei 37 ° C und lassen Sie Eizellen Settle nach unten, dann verwenden Sie ein gezogenes Pasteurpipette, um soviel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen.
    3. Fügen Sie 40 µL Hybridisierung Lösung mit Sonde (vorbereitet in Abschnitt 2) zu den Eizellen. Legen Sie die PCR-Röhrchen mit Eizellen in der PCR-Maschine und inkubieren Sie wie folgt: 37 ° C für 5 min, 92 ° C für 3 min, dann 37 ° C über Nacht. Nachdem die Eizellen Sonde hinzugefügt wird, halten sie in der Dunkelheit so weit wie möglich.
  4. Post-Hybridisierung Wäschen
    1. Heizen Sie 2 x SSCT + 50 % Formamid auf 37 ° C vor und bewahren Sie es an der Hybridisierung Inkubator. Mit einem BSA beschichtet P200 pipette Tipp, PCR-Röhrchen mit den Eizellen 100 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50 % Formamid hinzu und die Eizellen zu einem neuen 500 µL Microfuge Schlauch übertragen.
    2. Fügen Sie eine zusätzliche 400 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50 % Formamid gleichen Tube und lassen Sie die Eizellen bei 37 ° C in den Inkubator zu begleichen.
      Hinweis: Oft Absetzen dauert länger bei diesem Schritt. Es ist nicht ungewöhnlich, dass 15 Minuten oder länger. Ein Mangel an Geduld führt zu erheblichen Verlust der Eizellen.
    3. Waschen Sie die Eizellen 3 Mal für 20 min in 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50 % Formamid bei 37 ° C mit Rotation. Halten Sie Eizellen bei 37 ° C, während sie sich niederlassen.
    4. Waschen Sie die Eizellen 3 Mal für 10 min in 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50 % Formamid bei 37 ° C mit Rotation. Halten Sie Eizellen bei 37 ° C, während sie sich niederlassen.
    5. Waschen Sie bei Raumtemperatur die Eizellen für 10 min in 500 µL 2 x SSCT + 40 % Formamid auf eine Nutator. Waschen Sie die Eizellen für 10 min in 500 µL 2 x SSCT + 20 % Formamid. Waschen Sie die Eizellen für 10 min in 500 µL 2 X SSCT.
  5. Mit DAPI färben
    Achtung: DAPI ist giftig, angemessenen Schutz zu tragen.
    1. Waschen Sie Eizellen für 20 min in 500 µL DAPI Lösung (1 µg/ml) in 2 X SSCT auf der Nutator. Spülen Sie die Eizellen 3 Mal in 500 µL 2 X SSCT. Waschen Sie Eizellen 2 Mal für 10 min in 500 µL 2 X SSCT auf der Nutator. Proben können für bis zu 4 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert werden, bis sie bereit sind, auf Deckgläsern montieren.
  6. Montage
    Hinweis: Siehe Abbildung 3 für Werkzeuge benötigt.
    1. Statt einem Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläschen unter dem sezierenden Mikroskop. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Tube von Eizellen, zu etwa 150 µL Gesamt Lautstärke. Mit ein BSA beschichtet P200 Pipettenspitze, Pipette rauf und runter zu zerstreuen Eizellen in die Lösung, und übertragen Sie dann 40 µL der Eizellen/Lösung auf einem Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläschen.
    2. Entfernen Sie etwas von der Flüssigkeit aus dem Deckglas mit einer gezogenen Pasteurpipette, bis die Eizellen halten Sie sich an das Deckglas aber sind nach wie vor von Flüssigkeit umgeben. Halten Sie mit der Pinzette das Deckglas auf der einen Seite und verwenden Sie eine Wolfram-Nadel vorsichtig distanzieren Klumpen von Eizellen, verschieben sie eine einzelne Schicht aus nicht-überlappende Eizellen zu erreichen.
    3. Entfernen Sie den Rest der Flüssigkeit um die Eizellen mit einer gezogenen Pasteurpipette. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger und verwenden Sie komprimiertes Gas, Staub wegzublasen. Fügen Sie 22 µL Montage Medien (z. B.Prolong-GOLD) in der Mitte der Folie hinzu. Senken Sie langsam die Folie auf das Deckglas mit den Montage-Medien mit Blick auf die Probe, bis die Medien die Probe berührt. Oberflächenspannung wird dazu führen, dass das Deckglas auf der Folie haften.
    4. Platzieren Sie Folien in einem Plastikbehälter mit einem dicht schließenden Deckel, der eine Schicht aus frischen Trockenmittel (z.B. Drierite) enthält. Lassen Sie Folien für 3-5 Tage in der Dunkelheit vor Bildgebung trocknen. Trocknungszeit variieren je nach Luftfeuchtigkeit des Raumes.

6. Bildgebung

  1. Reinigen Sie auf trockenen Folien aus der Kiste mit Trockenmittel entfernen sie um Staubpartikel zu entfernen. Versiegeln Sie Deckgläsern mit Nagellack. Versiegelte Folien können auf unbestimmte Zeit gespeichert werden, bei-20 ° C.
  2. Laser-scanning-konfokale Bilder mit einer hoher numerischer Apertur 40 X Öl Objektiv mit 6 X digitaler Zoom zu erwerben.
    Hinweis: Im Idealfall Systemsoftware erlaubt eine zu finden und markieren die X-Y-Position des meiotische Chromosomen für mehrere Eizellen beim Betrachten sie mit Epifluoreszenz. Diese Funktion spart Zeit während einer bildgebenden Sitzung. Schnelle bleichen mit hoher numerischer Apertur 60 X Zielsetzung gemacht seine Verwendung ungeeignet mit der gewählten konfokale System, aber es kann für andere Systeme arbeiten.
  3. Ein Z-Serie für jede Eizelle, Einstellung der oberen und unteren Rand der Serie über das DAPI-Signal zu erfassen.
    Hinweis: Gewinnen, zu versetzen, und Laserleistung müssen empirisch über eine Teilmenge der Eizellen ermittelt werden. Sobald geeignete Parameter gefunden werden, sollten nur geringfügige Anpassungen vorgenommen werden müssen.
    Wenn Erwerb verändert Einstellungen erforderlich sind, die zuvor gesammelten Bildstapel verwenden, um die notwendigen Veränderungen abzuschätzen. Um zu vermeiden, Bleichen, absehen von Pre-imaging der Arm-Sonde vor der Aufnahme der Z-Serie. Mit einer Schrittweite von 0,25 µm Z-Serie in der Regel zwischen 25 und 30 Stufen je nach Ausrichtung und Platzierung der Chromosomen. Kleiner Schritt kann verbessern die Fähigkeit zu beurteilen, ob zwei Fisch-Spots sind in der axialen Dimension getrennt, aber es ein Kompromiss mit den Zeitaufwand ist für kleinere Schritte und Verlust der Signalintensität durch Bleichen zu erfassen. Eine 40 X Objektiv mit 6 X digitaler Zoom und ein 1.024 x 512 Bildfeld erzeugt Bilder mit einer Pixelgröße von 0,05 µm.

7. Image Analyse und Wertung für Zusammenhalt Mängel

  1. Deconvolve die Z-Serie um das Signal Rauschabstand für jede Eizelle19zu optimieren.
    Hinweis: Eine Software-Paket wie angegeben in der Materialtabelle erlaubt es, deconvolve mit integrativen Restaurierung sowie zuschneiden und Kontrast-Bilder verbessern. Wichtig ist, ist ein Softwarepaket, das erlaubt, Bilder und Ergebnis für Zusammenhalt Mängel in drei Dimensionen unerlässlich.
  2. Tabellieren Sie für jede Eizelle die Anzahl der Arm und Zentromer Herde, die mit dem DAPI-Signal colocalize. Verlust des Zusammenhalts führt in drei oder vier unterschiedliche und getrennte Signale für eine bestimmte Sonde. Es ist nicht ungewöhnlich, zwei Brennpunkte zu beobachten, die an einem dünnen Faden verbunden sind. Nach den strengsten Kriterien würden diese Herde nicht gelten "getrennt".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Abbildung 5 zeigt Bilder, die mit einem Arm-Sonde, zytologische Region 6E-7 b auf dem x-Chromosom hybridisiert . Diese Testergebnisse in ein Signal, das gemeinsam mit der DAPI lokalisiert, unterscheidet sich leicht vom Hintergrund und wird bereits erfolgreich eingesetzt, Arm Zusammenhalt Mängel in verschiedenen Genotypen19zu quantifizieren. Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel beschränkt war, prometaphase ich und Metaphase ich inszeniert; Eizellen vor Kernhülle Ausfall wurden von Analyse19ausgeschlossen. Eine intakte Kernhülle wird deutlich, wenn in den DAPI-Kanal zu scannen, da die Chromosomen der Eizelle durch eine diskrete Kreisfläche umgeben sein, die dunkler als die umgebende Zytoplasma.

Abbildung 5 b zeigt maximale Intensität Projektionen der einzelnen Z-Serie nach Entfaltung und Kontrast Verbesserung. Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel erfordert für jede Sonde bestimmen, dass die Zahl der Fische, dass Überschneidungen mit dem DAPI-Signal signalisiert. Für eine solche Analyse ist die Visualisierung der zusammengeführten Bilder in drei Dimensionen unerlässlich. Nur Fisch Spots, die eindeutig im Zusammenhang mit DAPI-Signal in allen drei Dimensionen sollten in die Analyse einbezogen werden.

Intakte Schwester Chromatids Zusammenhalt zeigt sich als zwei Fisch-Spots für den Arm und Pericentric Sonden (Abbildung 5 b, links). Eizellen mit drei oder vier getrennten Fisch-Spots für jede Sonde gelten Zusammenhalt Mängel (Abbildung 5 b, rechts). Um einzelne Flecken eingestuft werden, müssen zwei FISH-Signale minimal in allen drei Dimensionen durch einen Abstand entsprechend dem Durchmesser der kleinsten Stelle getrennt werden. Dünne schwache Fäden verbinden zwei Fische Flecken sind keine Seltenheit. Solche Signale gelten nicht völlig getrennt und daher nicht als Instanzen des Zusammenhalts Defekte gezählt.

Mit der 6E-7 b Arm Hybridisierung Sonde war ca. 15-20 % der Eizellen abgebildet komplett fehlte Signal oder das Signal zu schwach, um selbstbewusst zu erzielen. Darüber hinaus etwa 5 % der Eizellen abgebildet ausgestellt einen großen Bereich der diffusen chromosomalen Signal und diese wurden aus der Analyse verworfen. Im Gegensatz dazu war es selten, Eizellen zu begegnen, für die das Pericentric-Hybridisierung-Signal fehlt oder ist zu diffus, um Gäste war.

Die 6E-7 b Arm Sonde wurde ausgiebig genutzt, um Arm Zusammenhalt Mängel im prometaphase zu quantifizieren und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen19. Wenn die Cohesin Untereinheit SMC3 während Mid Prophase, 16,3 % der die reifen Eizellen analysiert enthaltenen abgerissen wurde größer als zwei Spots, bezeichnend für vorzeitigen Verlust der Kohäsion Arm arm. Im Gegensatz dazu haben wir beobachtet abgetrennten Arm Flecken nur 5,1 % der Eizellen, die normalen Niveaus von SMC319enthalten. Interessant ist, obwohl die Häufigkeit der Arm Zusammenhalt Mängel wurde in mehreren Knockdown Genotypen, Schwester, die Chromatiden selten in den Pericentric Regionen19getrennt wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Altersabhängige Verlust der Kohäsion in der erweiterten Prophase ich verhaften der weibliche Meiose führen zu Fehlern im Chromosom Abtrennung und Aneuploidie im Ei. Zusammenhalt ist vertreten durch schwarze Balken zwischen den Schwester Chromatiden. Arm Zusammenhalt funktioniert um rekombinante homologe zusammenzuhalten und ist erforderlich für genaue Trennung bei Anaphase ich. Wenn Arm Zusammenhalt vorzeitig verloren geht, kann Chromosom Missegregation auftreten, was zu einer Aneuploidie Ei. Diese Zahl wurde von Referenz19angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Größe der DNA-Moleküle nach BAC Fragmentierung und Verstärkung (links) und nach Beschränkung Enzym Verdauung (rechts) für drei verschiedene BACs. 400 ng der amplifizierten DNA-Produkte sind in den ersten drei Gassen gezeigt. Die letzten drei Bahnen zeigen DNA-Fragmente nach der Nacht Beschränkungsauswahl. Die amplifizierten DNA-Produkte reichen von 200 bp bis zu 3 kb. Nach der Beschränkungsauswahl, die meisten Fragmente reichte von 100-200 bp, aber größere Fragmente (bis zu 500 bp) waren zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Zytologie Werkzeuge. Instrumente aus dem Protokoll: (1) paar Zangen (#5 Dumont); (2) Wolfram Nadel; (3) Tiefbrunnen Schüssel mit Deckel; (4) flachen Glas sezieren Gericht; (5) zog Pasteurpipette. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Anordnung und Bewegung der Folien für rollende Eizellen. (A) schematische Darstellung der Folie eingerichtet zum Walzen von Eizellen, wie im Protokoll beschrieben. Die dunklere Bereich kennzeichnet den Milchglas Teil der Folie. (B) Richtung der Bewegung Vektoren für Folie #2 während der Eizelle Rollen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Fisch Test Ergebnisse. (A) Schaltplan zeigt das x-Chromosom von Drosophila , wo die beiden Sonden (6 BACs) zu bewaffnen und hybridisieren, die 22 Oligonukleotid Chromosomenregion Sonde im Protokoll beschrieben. Der Einfachheit halber die 6E-7 b-Sonde 7 b gekennzeichnet ist und die 2F - 3C-Sonde trägt 3 C. (B) repräsentative Bilder von Fisch Ergebnisse (6E-7 b-Sonde) für intakte Arm Zusammenhalt (zwei Arm-Sonde Flecken, einer pro Homolog) und den gestörten Arm Zusammenhalt (drei bis vier Arm-Sonde Flecken). DNA ist blau, das Arm-Sonde-Signal ist gelb und die Pericentric Sonde Signal ist rot. Bilder entsprechen höchster Intensität Projektionen der Z-Serie nach Entfaltung und Kontrast Verbesserung. Maßstabsleiste = 2 µm. Diese Zahl wurde von Referenz19angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Verwendung von Fisch-Sonden zur Bewertung des Zustands der Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen ist eine deutliche Weiterentwicklung im Bereich der Drosophila Meiose. In der Vergangenheit wurden Drosophila Forscher zu Gentests zu vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt in reifen Eizellen11,18,19folgern beschränkt. Nun kann mit der hier vorgestellten Methoden der Zustand der Arm Zusammenhalt untersucht werden direkt mit Fisch. Die Fähigkeit, physische Beweise für den vorzeitigen Verlust von Arm Zusammenhalt stark erhalten erweitert das Repertoire der Ansätze zur Verfügung, um die Mechanismen, die zum vorzeitigen Verlust der Kohäsion und Chromosom Missegregation Arm in Drosophila Eizellen führen zu studieren.

Wichtige Schritte
Obwohl wir keine systematische Analyse der kritischen Parameter für erfolgreiche Visualisierung von fluoreszierende Sonden, die auf einzelne Kopie Sequenzen entlang dem Chromosom Arm in reifen Eizellen Drosophila hybridisiert durchgeführt haben, bieten wir die folgende Liste von Faktoren, die für den Erfolg dieser Technik beigetragen haben könnten. Um die Arm-Sonde zu erzeugen, verwendet wir eine Kombination aus sechs überlappende BAC-Sonden, die decken ein Intervall von ca. 0,8 Mb auf dem X-Chromosom Arm. Unsere ersten Versuche mit weniger BACs, die eine kleinere Region erstreckten, waren nicht erfolgreich. Darüber hinaus haben wir eine Methode verwendet, zu fragmentieren und verstärken die BAC-DNA vor Ende-Beschriftung mit Alexa-647. Die Mehrheit der Einschränkung Fragmente, die etikettiert wurden, waren 100-200 bp lange (Abbildung 2), das stimmt gut mit der Zielgröße von 150 Nukleotiden, die notwendig ist für eine effiziente Diffusion durch dicke Gewebe21. Fixierung-Bedingungen, die Morphologie der große Drosophila Eizelle erhalten, sondern ermöglichen auch Sonde eindringen sind unerlässlich. Wir haben unsere bisher verwendeten Fixierung Methode23 verändert, indem Sie eine Lösung, die auf 37 ° c vorgewärmt Raumtemperatur Heptan hinzufügen Wir halten es für möglich, dass sowohl die Zugabe von Heptan, Eindringen durch die Dotterhäutchen Membran sowie die Absenktemperatur für Fixierung zu erhöhen, erfolgreiche Fixierung Bedingungen zur Visualisierung der Arm Zusammenhalt beigetragen.

Wenn für den vorzeitigen Verlust der Kohäsion prüfen, benötigt man eine Stichprobe, die Quantifizierung der Mängel ermöglicht, die anwesend sind bei niedrigen bis moderaten Niveau. Um große Zahlen von reifen Eizellen zu erhalten, haben andere Mixer Störung der adulten Weibchen gepaart mit 26,27Siebung verwendet. Hier beschreiben wir eine Methode zur hand sezieren Eierstöcke von 20-25 Frauen, mit manuelle Trennung des späten Stadium Eizellen durch pipettieren. Während die Mixer/Siebung-Methode auch mit diesem Protokoll arbeiten sollte, ist ein Vorteil der Hand Dissektion, dass ohne den siebenden Schritt Eizellen verbringen weniger Zeit im Puffer vor Fixierung, die die Chance der Anaphase abnimmt ich Beginn durch künstliche Ei Aktivierung. Darüber hinaus diese Methode erfordert weniger Frauen als Ausgangsmaterial, kleinere Mengen von Reagenzien verwendet, und hat einen einfacheren Workflow, der die Verarbeitung mehrerer Genotypen erleichtern.

Hand-Dissektion und manuelle Trennung von reifen Eizellen Chorion und Feuersbrunst Membran Entfernung Eizellen zu "Rollen" in ausreichender Menge vorsieht und führt in ca. 75-150 Eizellen am Ende der Hybridisierung wäscht. Ein Trick, um den Ertrag zu maximieren Metaphase ich verhaftet Eizellen jungfräuliche Weibchen in yeasted Fläschchen in Abwesenheit der Männer vor Dissektion25halten soll. Eizelle Rollen um Chorions und Dotterhäutchen Membranen entfernen muss mit einem sanften Hauch durchgeführt werden, um nicht zu zerstören Eizellen. Jedoch entfernen Chorions und Dotterhäutchen Membranen aus 100 % der Eizellen ist kein realistisches Ziel und übermäßige Rollen nur führt zu Verlust von Eizellen. Daher sollte jedem rollenden Zyklus gestoppt werden bei ca. 75-85 % der Eizellen fehlen Chorions und Dotterhäutchen Membranen.

Einschränkungen
Trotz unseres Erfolges zu generieren und mit Arm Sonden überwachen den Zustand des Zusammenhalts in der reife Eizellen von Drosophila leidet das Verfahren noch Einschränkungen. Während wir nicht selten ein Signal für die Chromosomenregion Sonde zu erkennen, war das Arm-Sonde-Signal schwach oder nicht vorhanden in ca. 15-20 % der Eizellen, dass wir ein Image erstellt. Ein beitragender Faktor möglicherweise differenziellen Durchdringung des Prüfpunkts Pericentric Oligonukleotid (22-28 Nukleotide) im Vergleich zu den größeren Arm-Sonde (100-200 Nukleotide). Darüber hinaus ist die große repetitiven Sequenz von der Pericentric Sonde resultiert ein Signal, das heller ist als die für die Arm-Sonde erkannt. Die Ausrichtung der Eizelle und der Platzierung von meiotischen Chromosomen in der Eizelle sind auch eine Herausforderung beim abbilden. Obwohl die meiotischen Chromosomen relativ in der Nähe der Zelle Kortex sind, ist es unmöglich, die Ausrichtung der Eizelle zu steuern, bei der Montage auf das Deckglas. Daher in einigen Bruchteil der Eizellen, die meiotischen Chromosomen möglicherweise 100-200 µm aus dem Deckglas und die Signalstärke und Qualität kann negativ beeinflusst werden, wenn Sie versuchen, durch den Großteil der Eizelle Bild. Diese Einschränkungen bedeuten, dass die Anzahl der Eizellen enthalten in der abschließenden Quantitative Analyse deutlich geringer als die Anzahl der Eizellen, die in das Protokoll verarbeitet. Ermitteln des Status des Arm Zusammenhalt in 100 Eizellen wird höchstwahrscheinlich zwei unabhängige Vorbereitungen erfordern. Ein zusätzliche limitierender Faktor bei der Quantifizierung Zusammenhalt Mängel mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop ist der Zeitaufwand für eine typische Z-Serie (ca. 5 min), erfassen Wenn der erfasste Bereich auf 1.024 x 512 Pixel beschränkt ist. Dies bedeutet, dass der Vergleich des Zusammenhalts in Kontrolle und experimentelle Genotypen (100 Eizellen) ca. 16 h Bild Sammlungsuhrzeit erfordern wird.

Modifikationen und Fehlerbehebung
Wir konnten den Zustand des Zusammenhalts der Arm mit einer Sonde, die das x-Chromosom bei zytologischen Position 6E-7 b19 erkennt. Eine Sonde, die an eine mehr distalen Position auf dem x-Chromosom hybridisiert kann zur Erkennung von dem Scheitern des Chiasma Wartung mehr wünschenswert. Darüber hinaus können andere Forscher Arm Zusammenhalt auf anderen Chromosomen analysieren möchten. Während wir nicht versucht haben, die Autosomen Sonde, zufolge die vorläufigen Daten eine Sonde, die die 2F - 3 C-Region des x-Chromosoms auch erkennt ein nachweisbares Signal führt. Jedoch kann basierend auf begrenzte vorläufige Daten, das Signal des Prüfpunkts 2F - 3 C weniger als die für die 6E-7 b-Sonde "kompakt" sein. Obwohl die Fische Signale fest und knackig für einige Eizelle Chromosomen sind, ist das Hybridisierung Signal auf den Chromosomen der anderen Eizellen wesentlich diffuser. Ob diese Unterschiede im Signal echte Unterschiede bei Chromosom Morphologie zwischen den beiden Standorten zytologischen widerspiegeln, Variabilität der Hybridisierung Effizienz der beiden Sonden oder nur stochastische Variabilität zwischen verschiedenen Eizellen wird erfordern Sie eine tiefer gehende Analyse.

Wichtig ist, auch für die 6E-7 b-Sonde, beobachteten wir eine diffuse chromosomale Signal in einige Eizellen, und dies erforderte häufig ihren Ausschluss aus der Analyse. Darüber hinaus wir unterschiedliche Signalqualität und Helligkeit zwischen verschiedenen Zubereitungen der 6E-7 b-Sonde bemerkt haben und dies erforderte, dass Bildgebung Parameter entsprechend angepasst werden. Die Hybridisierung bis 42 ° C Temperaturerhöhung nicht reduzieren die Anzahl der Eizellen mit diffusen Signal, aber es das Signal für die Pericentric-Oligonukleotid-Sonde erheblich beeinträchtigen. In dem Bemühen, Chromosom Morphologie24besser zu bewahren wir auch versucht einen längeren Denaturierung Schritt bei einer niedrigeren Temperatur (80 ° C), aber festgestellt, dass diese Behandlung die Signalintensität erhöht weder die Anzahl der Eizellen mit diffusen reduziert chromosomale Fisch Signal. Auch versuchten wir mit 12 überlappenden BACs entspricht ein ca. 1,5 Mb-Intervall, das zytologische Region 5E-7 b überspannt ein heller Arm-Signal erhalten. Bei der Verwendung von einer 12 BAC-Sonde war der Grad der Variation Signalintensität sowie der Anteil der Eizellen Signal fehlt nichts anderes als wenn sechs BACs verwendet wurden, um die Arm-Sonde zu machen. Es war auch schwieriger, für Zusammenhalt Mängel zu erzielen, wenn die 12 BAC-Sonde zu verwenden, da die Fisch-Signale größer, so dass es schwieriger zu Flecken, die einzelnen Chromatiden entsprechend zu lösen waren. In Fällen, in denen kein Signal mit einer neu vorzubereitenden Sonde erhalten ist, Forscher sollten überprüfen Sie die Größe von der verstärkten und Einschränkung verdaut BAC DNA zu bestätigen, dass die Fragmente für Ende Kennzeichnung verwendet in erster Linie im Bereich 100-200 bp sind. Dies ist wahrscheinlich einer der wichtigsten Faktoren für erfolgreiche Sonde Vorbereitung.

Zukünftige Richtungen
Zukünftige Arbeit, Bildaufnahme sowie die Anpassung des Protokolls um Immunostaining gehören zu verbessern wäre Hauptverbesserungen, die andere Forscher profitieren würden. Während Bildersammlung wäre sammeln eine größere Anzahl von Bildern in der axialen Dimension sowie schnellere Bildaufnahme zur Quantifizierung der Zusammenhalt Mängel vorteilhaft. Bei der Optimierung der bildgebenden Parameter für die konfokale Laserscanning, fanden wir, dass 0,25 µm war die kleinste Schrittweite, die für die Z-Serie verwendet werden könnten, zur Vermeidung von nennenswerten bleichen des Fisches signalisiert. Jedoch für Fisch-Signale, die von weniger als 0,25 µm in der Z-Stapel getrennt sind, kann dieser Schrittgröße scheitern, den "Raum" zwischen die Herde zu erfassen und kann daher die Anzahl der Zusammenhalt Defekte unterschätzen. Die schnellere Bildgeschwindigkeit Erwerb einer drehenden Scheibe konfokale können kleinere Schrittweiten ohne Signal bleichen verwendet werden. Dies würde eine genauere Bildrekonstruktion in der axialen Dimension sowie ermöglichen größere Anzahl von Eizellen für Zusammenhalt Mängel analysiert werden. Darüber hinaus würde die Fähigkeit, mit Fisch-Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt Immunostaining kombinieren das Protokoll erheblich verbessern. Für eine Reihe von Vorbereitungen haben wir versucht, Spindel Immunostaining nach der Hybridisierung-Verfahren durchführen. Allerdings war die robuste Spindel Färbung sichtbar in nur ein Bruchteil der Eizellen. Darüber hinaus aus Gründen, die nicht klar sind, umgeben höhere Fisch Störsignale die meiotischen Chromosomen als Fisch und Immunostaining kombiniert wurden. Weitere Arbeiten zur Optimierung des Protokolls um Immunostaining entweder vor oder nach dem Fisch-Verfahren erlauben würde die Fähigkeit, diese Technik erheblich erweitern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH Grant GM59354 an Sharon E. Bickel vergeben unterstützt. Wir danken für die Unterstützung bei der Ausarbeitung des Protokolls für die Erzeugung von fluoreszierenden Arm Sonden, Ann Lavanway Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie und J. Emiliano Reed für technische Hilfe Huy Nguyen q. Wir danken auch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen in der Drosophila-Community für hilfreiche Gespräche und Beratung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Ausgabe 130 Drosophila Meiose Eizelle Entwicklungsbiologie Schwester Chromatids Zusammenhalt Arm Zusammenhalt Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH)
Fluoreszenz <em>In Situ</em> Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich <em>Drosophila</em> Eizellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter