Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas
Summary
Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.
Abstract
Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.
Introduction
Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar1. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxycytosine (5caC). Oxidação mediada por TET 5mC impõe uma camada adicional de controle epigenético do genoma dos mamíferos. A descoberta do TET provocou intenso interesse no campo epigenético para desvendar as funções biológicas das proteínas TET e 5hmC seu produto principal catalítico. 5hmC não é apenas um intermediário durante o TET-mediado ativo DNA desmetilação2,3,4, mas também atua como um estábulo epigenética marca5,6,7,8 . Apesar de hydroxymethylation de DNA é altamente correlacionada com a expressão de gene e aberrante mudanças no DNA hydroxymethylation estão associadas a algumas doenças humanas9,10,11, as relações causais entre as modificações epigenéticas no DNA e os fenótipos frequentemente permanecem um desafio a ser estabelecida, que pode ser parcialmente atribuída à falta de uma ferramenta confiável com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em definido pelo temporal e espacial resolução.
Aqui nós relatamos o uso de um produto químico-inducible Epigenoma remodelar ferramenta (cidra) para superar o obstáculo que enfrentam os estudos de relações causais entre transcrição hydroxymethylation e gene de DNA. O design é baseado no pressuposto de que o domínio catalítico de TET2 (TET2CD) pode ser dividido em dois fragmentos inativos quando expressa em células de mamíferos e sua função enzimática pode ser restaurada por uma abordagem de dimerização quimicamente inducible ( Figura 1A). Para estabelecer um sistema de separação-TET2CD, nós selecionamos seis locais em TET2CD, composto por uma região rica em Cys e uma dobra dupla-hélice β-hélice (DSBH), com base em uma estrutura de cristal relatado do ADN TET2-complexo que carece de uma região de baixa complexidade12. Um sintético gene que codifica a proteína dimerização rapamicina-inducible módulo FK506 12 (FKBP12) e domínio de ligação FKBP rapamicina (FRB) de mamíferos alvo de14,rapamicina15, juntamente com um peptídeo Self chicotado T2A polipeptídeo sequência16,17, individualmente foi inserido em sites selecionados dividido dentro de TET2CD. A seleção de TET2 como nosso alvo engenharia baseia-se as seguintes considerações. Mutações somáticas, primeiras no TET2 com concomitante redução de hydroxymethylation de DNA são frequentemente observadas em doenças humanas incluindo distúrbios mieloides e câncer10, que fornece informações úteis em locais sensíveis deve ser evitada para inserção. Em segundo lugar, uma grande fração do domínio catalítico TET2, particularmente a região de baixa complexidade, é dispensável para a função enzimática12, permitindo assim que um split-TET2 minimizado para modificações epigenéticas inducible do ofício. Após a triagem de mais de 15 construções, uma construção que exibiu maior restauração rapamicina-inducible da sua actividade enzimática no sistema dos mamíferos foi escolhida e designada como cidra18. Neste documento descrevemos o uso de mCherry-tag cidra para alcançar hydroxymethylation de DNA inducible e epigenéticas remodelação com rapamicina e apresentar três métodos para validar a produção 5hmC mediada por cidra em um sistema celular modelo HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC1,2,3, 4,5,<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a financeira das sustentações do National Institutes of Health concedem (R01GM112003 para YZ), Fundação Welch (BE-1913 a YZ), a American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE para YZ), a prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (RR140053 a YH, RP170660 para YZ), a associação americana do coração (16IRG27250155 a YH) e o programa de prêmio de pesquisa colaborativa de fundação de John S. Dunn.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
Riferimenti
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