División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos
Summary
Protocolos detallados para la introducción de una enzima de la división ingeniería-TET2 (sidra) en células de mamífero para químicas inducible hydroxymethylation de ADN y remodelación epigenéticos se presentan.
Abstract
Metilación del ADN es una modificación epigenética estable y heredable en el genoma mamífero y participa en la regulación de expresión génica para controlar las funciones celulares. La inversión de la metilación del ADN o la desmetilación del ADN, está mediada por la familia de proteínas de translocación (TET) de diez-once de dioxygenases. Aunque se ha reportado ampliamente que aberrante metilación del ADN y desmetilación se asocian a defectos del desarrollo y cáncer, cómo estos cambios epigenéticos contribuyen directamente a la posterior alteración en la progresión de enfermedad o expresión de gen sigue siendo confuso, en gran parte debido a la falta de herramientas fiables para exactamente agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en resolución temporal y espacial definido. Para superar este obstáculo, se diseñó una enzima TET2 split para permitir el control temporal de la 5-METILCITOSINA (5mC) oxidación y posterior remodelación de Estados epigenéticos en células de mamífero simplemente añadiendo productos químicos. Aquí, describimos los métodos para la introducción de una herramienta remodelación del epigenoma química-inducible (sidra), basado en una enzima ingeniería split-TET2, en células de mamífero y cuantificar la producción inducible química de la 5-hidroximetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometría de flujo o un análisis de dot-blot. Esta herramienta remodelación del epigenoma inducible por la química encuentra amplio uso interrogando a sistemas celulares sin alterar el código genético, así como en las relaciones epigenotype−phenotype de sondeo en diversos sistemas biológicos.
Introduction
La metilación del ADN, en su mayoría se refiere a la adición de un grupo metilo a la posición del carbono 5 del citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC), es catalizada por la DNA metil-transferasa (DNMTs). 5mC actúa como una marca epigenética más importante en el genoma mamífero que a menudo las señales de represión transcripcional, la inactivación del X-cromosoma y transposon silenciamiento1. La inversión de la metilación del ADN está mediada por la familia de proteínas diez elfos desplazamiento (TET). Enzimas de TET pertenecen al hierro (II) y 2-oxoglutarato dioxygenases dependiente que catalizan la oxidación sucesiva de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxycytosine (5caC). Oxidación mediada por TET 5mC impone una capa adicional de control epigenético del genoma mamífero. El descubrimiento de TET ha despertado gran interés en el campo de la epigenético para desvelar las funciones biológicas de las proteínas del TET y sus 5hmC principales productos catalíticos. 5hmC no es sólo un intermedio durante el TET-mediada activa ADN desmetilación2,3,4, pero también actúa como un establo epigenético marca5,6,7,8 . Aunque hydroxymethylation de ADN es altamente correlacionado con la expresión génica y aberrante cambios en ADN hydroxymethylation se asocian con algunos trastornos humanos9,10,11, las relaciones causales entre las modificaciones epigenéticas en el ADN y los fenotipos permanecen a menudo difíciles de establecer, que se puede atribuir parcialmente a la falta de una herramienta confiable con precisión agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en definida temporal y espacial resolución.
Aquí divulgamos el uso de un epigenoma químicas inducibles remodelación herramienta (sidra) para superar el obstáculo que enfrentan los estudios de las relaciones causales entre ADN hydroxymethylation y gene la transcripción. El diseño se basa en el supuesto de que el dominio catalítico de TET2 (TET2CD) puede dividirse en dos fragmentos inactivos cuando se expresa en células de mamíferos y su función enzimática puede ser restaurado por un enfoque de dimerización químicamente inducible ( Figura 1A). Para establecer un sistema split-TET2CD, se seleccionaron seis sitios en TET2CD, compuesto de una región rica en Cys y un pliegue doble hebra β-helix (DSBH), sobre la base de una estructura cristalina divulgado del complejo TET2-ADN que carece de una complejidad baja región12. Un gen sintético que codifica proteína inducible por la rapamicina dimerización módulo FK506 12 (FKBP12) y dominio de unión a rapamicina FKBP (FRB) del blanco mamífero de rapamicina14,15, junto con un péptido auto Hendedoras T2A polipéptido secuencia16,17, individualmente fue insertado en los sitios de fractura seleccionados en TET2CD. La selección de TET2 como nuestro destino de ingeniería se basa en las siguientes consideraciones. En primer lugar, somáticas mutaciones en TET2 con reducción concomitante de ADN hydroxymethylation se observan con frecuencia en desordenes humanos incluyendo desordenes mieloides y cáncer10, que proporciona información útil en sitios sensibles a evitarse para inserción. En segundo lugar, una gran parte del dominio catalítico TET2, particularmente la región de baja complejidad, es prescindible para la función enzimática12, lo que nos permite diseñar un split-TET2 minimizado por modificaciones epigenéticas inducibles. Después de evaluar más de 15 construcciones, una construcción que exhiben restauración rapamicina-inducible más alto de su actividad enzimática en el sistema mamífero fue elegida y designada como sidra18. En este documento se describe el uso de sidra etiquetada mCherry inducible ADN hydroxymethylation y remodelación epigenéticos con rapamicina y presentan tres métodos para la validación de 5hmC mediada por la sidra de producción en un sistema celular modelo HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos ilustrado el uso de una enzima de split-TET2 ingeniería para lograr un control temporal de hydroxymethylation de ADN. Tras el descubrimiento de la familia de TET de 5 methycytosine dioxigenasa, se han realizado muchos estudios para descifrar las funciones biológicas de las proteínas de TET y sus principales productos catalíticos 5hmC1,2,3, 4,5…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la concesión de ayudas de los institutos nacionales de salud (R01GM112003 a YZ), la Fundación de Welch (BE-1913 a YZ), la sociedad americana del cáncer (RSG-16-215-01 TBE a YZ), la prevención del cáncer y Research Institute of Texas (RR140053 al albergue, RP170660 a YZ), la Asociación Americana del corazón (16IRG27250155 al albergue) y el programa de premios de investigación Fundación de John S. Dunn.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
Riferimenti
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