Oogbeschadigingen en/of Kinematics gemeten door In Vitro stimulatie van de craniale zenuwen in de schildpad
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe u een in vitro geïsoleerd schildpad hoofd voorbereiding voor het meten van de kinematica van hun oogbewegingen. Na verwijdering van de hersenen van de schedel, worden craniale zenuwen gestimuleerd met stromingen te kwantificeren rotaties van de ogen en veranderingen in de maten van de leerling.
Abstract
Nadat de dieren zijn euthanized, beginnen hun weefsels te sterven. Schildpadden hebben een voordeel vanwege een langere overlevingstijd van hun weefsels, vooral vergeleken met warmbloedige gewervelde dieren. Hierdoor kunnen in vitro experimenten in schildpadden voor langere tijd te onderzoeken van de neurale signalen en beheersing van hun gerichte acties worden uitgevoerd. Met behulp van een geïsoleerde hoofd voorbereiding, we gemeten de kinematica van oogbewegingen in schildpadden en hun modulatie door elektrische signalen die door craniale zenuwen. Nadat de hersenen werd verwijderd uit de schedel, werd en de hersenzenuwen intact, de ontleed hoofd geplaatst in een gimbal kalibreren oogbewegingen. Glas elektroden aangesloten op craniale zenuwen (oculomotor, trochlear, en abducens) en gestimuleerd met stromingen te roepen van de oogbewegingen. We bewaakt oogbewegingen met een infrarood video tracking systeem en gekwantificeerde rotaties van de ogen. Huidige pulsen met een scala aan amplitudes, frequenties, en trein duur werden gebruikt voor het observeren van de effecten op de reacties. Omdat de voorbereiding is gescheiden van de hersenen, kan de efferent pathway gonna spier doelen in afzondering te onderzoeken neurale signalering bij gebrek aan centraal verwerkte sensorische informatie worden onderzocht.
Introduction
Reden voor het gebruik van Red-eared schuifregelaar schildpadden in elektrofysiologische experimenten:
Red-eared schuifregelaar schildpadden (Trachemys scripta elegans), worden beschouwd als een van’s werelds ergste invasieve soorten1 en kunt aangeven dat een ecosysteem is in de problemen. De reden waarom rood-eared schuifregelaar schildpadden zo succesvol zijn is slecht begrepen, maar het kan ten dele te wijten zijn aan hun tolerante fysiologie en het bezit van nerveuze weefsels die onder hypoxische voorwaarden2,3,4 overleven kunnen . Ze gebruikt voor experimenten geen bedreiging voor hun nummers vormt en met minimale inspanningen, elektrofysiologische preparaten levensvatbare over uitgebreide duur, zo lang als 18 uur5,6 blijven kunnen. Het voordeel is vergelijkbaar met het voordeel van het gebruik van ongewervelde dieren zoals rivierkreeft7, die hebben ook de mogelijkheid om te weerstaan lage niveaus van zuurstof8.
Technieken voor het meten van oogbewegingen:
Benaderingen voor het meten van oogbewegingen bij frontale-eyed dieren met behulp van niet-menselijke primaten zijn goed ontwikkelde9. Het oog draait in de baan rond drie assen: horizontale, verticale en torsional. De methode van de spoel magnetisch search wordt algemeen beschouwd als de meest betrouwbare voor meten rotaties, maar is invasief, waarbij kleine spoelen moet worden ingevoegd in de scleras van dieren10,11. Video-gebaseerde systemen kunnen ook meten van rotaties en hebben het voordeel dat ze niet-invasieve. De ontwikkeling van betere camera’s samen met innovatieve beeldverwerking heeft zeer uitgebreide hun functionaliteit maken video-gebaseerde systemen een aantrekkelijk alternatief voor Overweeg12,13,14.
De technieken ontwikkeld voor het meten van oogbewegingen in nonmammals geweest veel minder groot. Maatregelen zijn beide lage resolutie of beschrijven slechts enkele van de rotaties15,16,17,18. Het gebrek aan ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de moeilijkheid in nonmammals van de opleiding te volgen van visuele doelen. Hoewel oogbewegingen goed zijn bestudeerd in rood-eared schuifregelaar schildpadden19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, vanwege de uitdaging in de opleiding dieren voor het bijhouden van doelen, de precieze kinematica van hun oogbewegingen is slecht begrepen.
Red-eared schuifregelaar schildpadden worden algemeen beschouwd als laterale-eyed gewervelde dieren, maar omdat ze hun hoofd volledig in hun shell31 intrekken kunnen, aanzienlijke occlusie van de laterale visual velden door het kopborststuk komt32. Het resultaat is dat hun visuele lijn van het zicht is gedwongen naar de voorkant, waardoor ze zich meer gedraagt als frontale-eyed zoogdieren. Dus, het gebruik ervan als een model voor de ontwikkeling van methoden voor het meten van oogbewegingen biedt ook een unieke evolutionair perspectief.
Het protocol beschreven in dit werk gebruikt een in vitro geïsoleerd hoofd voorbereiding om te identificeren van de kinematica van de oogbewegingen in rood-eared schuifregelaar schildpadden. Hersenen worden ontleed van de schedels en de hersenzenuwen intact. Hoofden worden in een gimbal kalibreren oogbewegingen te roepen reacties geplaatst door elektrische stimulatie van de hersenzenuwen die de spieren van het oog innervating. Maatregelen van rotaties door de ogen worden gedaan door een video-gebaseerd systeem, met behulp van softwarealgoritmen, die de donkere leerling en de markeringen van de iris volgen. De voorbereiding biedt de mogelijkheid voor het meten van kinematica van beide extraocular (d.w.z., horizontale, verticale en torsional rotaties)32 en intraoculaire (d.w.z., leerling wijzigingen)33 bewegingen.
Modelsysteem voor analyse van Efferent zenuwbanen:
Meer in het algemeen, de aanpak biedt onderzoekers de kans om te bestuderen hoe efferent neurale signalen genereren oogbewegingen wanneer spieren beginnen uit hun ontspannen Staten en in de afwezigheid van geïntegreerde sensorische informatie verwerkt door de hersenen32, 33. Daarom kan het oog bewegingen worden onderzocht in een modelsysteem waarin ze alleen worden verwerkt door de efferent neurale route verlaten van de hersenen en synapsing op de spieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen:
De kritische stappen binnen dit protocol zijn de volgende: 1) de dissectie en de zorgvuldigheid om de levensvatbaarheid van de transected zenuwen; 2) de onderlinge afstemming van de maten door de zuigkracht elektroden aan craniale zenuwen consequent te reageren; en 3) de plaatsing van het hoofd in de gimbal om voldoende kalibratie van de rotaties van het oog.
Problemen oplossen:
De dissectie kan uitdagend, maar na het een paa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Mrs. Paulette McKenna en Lisa Pezzino in deze studie voor secretariële ondersteuning en Mr. Phil Auerbach voor technische ondersteuning. De auteurs bedanken ook Drs. Michael Ariel en Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) voor het introduceren van ons aan de hoofd voorbereiding in vitro geïsoleerd. Financiering voor de ondersteuning van deze samenwerking werd verstrekt door het Department of Biology (Robert S. Chase Fonds), de academische Commissie van onderzoek en het programma van de neurowetenschappen aan het Lafayette College. Tot slot, dit werk is opgedragen aan m. Phil Auerbach, die overleed op 28 September 2016; hij een Scannende Elektronen Microscoop ontmanteld en het nut van de 5-assige fase voor gebruik in dit protocol herkend. Zijn vriendschap en vindingrijkheid zal sterk worden gemist.
Materials
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
Riferimenti
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. . The neurology of eye movements. , (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -. J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A “beat-to-beat” interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R., et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R., et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H., Harless, M., Morlock, H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. , 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil’s response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
