Oküler kinematik Vitro uyarılması kaplumbağa kranial sinirler tarafından ölçülen
Summary
Bu iletişim kuralı bir vitro izole kaplumbağa kafa hazırlık onların göz hareketleri kinematik ölçmek için nasıl kullanılacağını açıklar. Kafatası beyin kaldırıldıktan sonra kranial sinirler rotasyonlar göz ve öğrenci boyutlarda değişiklikleri ölçmek için akımları ile uyarılmış.
Abstract
Hayvan are euthanized sonra onların dokular ölmeye başlar. Kaplumbağaları özellikle sıcak kanlı omurgalılar için karşılaştırıldığında onların dokular, bir daha uzun yaşam süresi nedeniyle bir avantaj sunuyor. Bu nedenle, uzun bir süre sinir sinyalleri araştırmaya ve hakim olmak-in onların hedef eylemler için kaplumbağaları vitro deneyler yapılabilir. İzole bir baş hazırlık kullanarak, kaplumbağalar göz hareketleri kinematik şiddetindeydi ve onların modülasyon tarafından elektrikle ilgili sinyal kranial sinirler tarafından taşınan. Kranial sinirler dokunmadan beyin kafatasından kaldırdıktan sonra disseke kafa göz hareketleri ayarlamak için bir yalpa yerleştirildi. Cam elektrotlar kranial sinirler için bağlı (oculomotor, trochlear ve abducens) ve göz hareketleri yaratamayacak akımların ile uyarılmış. Kızılötesi bir video izleme sistemi ve gözlerin quantified rotasyonlar ile göz hareketleri izlenir. Geçerli genlikleri, frekansları, bir dizi ile bakliyat ve tren süreleri yanıt üzerindeki etkileri gözlemlemek için kullanıldı. Hazırlık beyinden ayrılır çünkü sinir merkezi olarak işlenmiş duyusal bilginin yokluğunda sinyal araştırmak için izole kas hedefe gidiş efferent yol incelenebilir.
Introduction
Gerekçe kaymak kırmızı kulaklı kaplumbağaların elektrofizyolojik deneylerde kullanmak için:
Kırmızı kulaklı kaymak kaplumbağaları (Trachemys scripta elegans), dünyanın en kötü istilacı türlerin1 biri olarak kabul edilir ve bir ekosistem dertte belirtebilirsiniz. Neden kaymak kırmızı kulaklı kaplumbağaların çok başarılı olduğunu neden kötü anlaşılmaktadır ama kısmen hoşgörülü fizyolojisi ve bulundurma hipoksik koşulları2,3altında,4 yaşayabilir gergin dokuların nedeniyle olabilir . Onları istimal o için deneme sayıları tehdit etmediğini ve en az çaba ile elektrofizyolojik hazırlıkları üzerinde genişletilmiş süreleri, 18 saat5,6sürece canlı kalabilir. Ayrıca oksijen8seviyesinin düşük dayanacak şekilde şifreleyebilirler kerevit7gibi omurgasız hayvanlar kullanmanın yararı için benzer bir şeydir.
Göz hareketleri Ölçme teknikleri:
Yaklaşımlar göz hareketleri içinde ön gözlü hayvan insan dışı primatlar kullanarak ölçmek için iyi gelişmiş9olmuştur. Göz yörüngede yaklaşık üç eksen döndürür: yatay, dikey ve burulma. Manyetik arama bobini yöntemi genellikle ölçüm rotasyonu için en güvenilir olarak kabul edilir, ancak invaziv, hayvanlar10,11scleras eklenecek küçük bobinleri gerektiren. Video tabanlı sistemler de rotasyonlar ölçebilir ve non-invaziv olma avantajına sahip. Yenilikçi görüntü işleme ile birlikte daha iyi fotoğraf makinesi gelişimi video tabanlı sistemler12,13,14düşünün için cazip bir alternatif yapmak işlevselliğini arttırmak.
Nonmammals göz hareketleri ölçmek için geliştirilmiş teknikleri daha az önemli olmuştur. Önlemler de düşük çözünürlükte ya da rotasyonlar15,16,17,18yalnızca bazıları açıklanmaktadır. Görsel hedefleri takip etmek eğitim nonmammals zorluk üzerinde geliştirme eksikliği kısmen sorumlu. Her ne kadar göz hareketleri de kırmızı kulaklı kaymak kaplumbağalar19,20,21,22,23,24,25 incelenmiştir ,26,27,28,29,30, hedefleri, izlemek için nedeniyle eğitim hayvanlarda göz hareketleri kesin kinematik mücadeledir kötü anladım.
Kaydırıcıyı kırmızı kulaklı kaplumbağaların genellikle lateral gözlü omurgalılar kabul, ama onlar tamamen kafalarının onların kabuk31geri çekmek, kabuğu tarafından yanal visual alanlarının önemli tıkanıklığı32oluşur. Onların görsel bakış açısı onları daha çok ön gözlü memeliler gibi çalışır hale önüne doğru zorlanır sonucudur. Bu nedenle, bunların kullanımı bir model olarak göz hareketleri ölçmek için yaklaşımlar geliştirmek için benzersiz bir evrimsel bakış açısı sunuyor.
Bu çalışmada açıklanan protokol bir izole vitro baş hazırlık kaymak kırmızı kulaklı kaplumbağaların göz hareketlerinde kinematik tanımlamak için kullanır. Beyin kranial sinirler dokunmadan kafatasları kesmiştim. Kafa göz hareketleri kalibre ve yanıt-e doğru anımsatmak için yalpa kranial sinirler göz kasları innerve elektriksel stimülasyon tarafından yerleştirilir. Önlemler dönmenin gözler tarafından karanlık bir öğrencisi ve iris işaretleri takip Yazılım algoritmaları kullanarak bir video tabanlı sistem tarafından yapılır. Hazırlık Gözdışı ikisinin kinematik (yani, yatay, dikey ve burulma rotasyonlar) ölçmek için fırsat sağlar32 ve göz içi (yani, öğrenci değişiklikleri)33 hareketleri.
Efferent sinirsel yollar analiz için sistem modeli:
Daha genel olarak, yaklaşım nasıl efferent sinir sinyalleri çalışma fırsatı oluşturmak göz hareketleri kaslar rahat durumlarına ve beyin32tarafındanişlenen entegre duyusal bilgi yokluğunda başlattığınızda müfettişler sağlar, 33. Bu nedenle, onlar sadece efferent sinir yolu bırakarak beyin ve kaslar synapsing tarafından işlenme bir modeli sistemi göz kinematik incelenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik adımlar:
Bu iletişim kuralı içinde önemli adımlar şunlardır: 1) diseksiyon ve transected sinirler; canlılığı korumak için alınan bakım 2) boyutları kranial sinirler tutarlı yanıtlar sağlamak için emme elektrotlar tarafından eşleşen; ve 3) dönmenin gözün yeterli kalibrasyon sağlamak için yalpa kafasından yerleşimini.
Sorun giderme:
Diseksiyon zor olabilir, ama bir kaç kez tamamladıktan sonra adımları nisp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Bayan Paulette McKenna ve sekreterlik desteği için bu çalışmada Lisa Pezzino ve Bay Phil Auerbach teknik destek için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Drs. Michael Ariel ve Michael S. Jones (Saint Louis Üniversitesi Tıp Fakültesi) izole vitro baş hazırlık için bize tanıtmak için teşekkür ederiz. Bu işbirliği destek için fon Biyoloji bölümü (Robert S. Chase Fonu), akademik araştırma komitesi ve Lafayette Koleji’nde sinirbilim programı tarafından sağlandı. Son olarak, bu eser 28 Eylül 2016 yılında vefat eden Bay Phil Auerbach adanmıştır; taramalı elektron mikroskobu hizmet dışı ve 5 eksenli sahne bu iletişim kuralını kullanmak için kullanışlılığı tanıdı. Onun dostluk ve güçlülük çok özleyeceğiz.
Materials
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
Riferimenti
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. . The neurology of eye movements. , (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -. J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A “beat-to-beat” interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R., et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R., et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H., Harless, M., Morlock, H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. , 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil’s response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
