Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1
Summary
Текущий мультиплексированных диагностики для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге вирусов требуется Комплекс пробоподготовки и дорогой аппаратуры и трудно для использования в условиях ограниченных ресурсов. Мы покажем диагностики, который использует изотермической амплификация с целевыми стренги переносные датчики для обнаружения и дифференцировать эти вирусы с высокой чувствительностью и специфичностью.
Abstract
Зика, денге и чикунгунья вирусы передаются комарами, вызывая заболевания с похожими симптомами пациента. Однако они имеют различные течению пациента к пациенту передачи потенциалы и требуют весьма различные лечения пациентов. Таким образом недавние вспышки Зика делают настоятельно необходимым разрабатывать инструменты, которые быстро дискриминацию этих вирусов в больных и ловушку комаров, чтобы выбрать правильное лечение пациентов и чтобы понять и управлять их эпидемиологии в режиме реального времени.
К сожалению, текущие диагностические тесты, включая те принимающей 2016 чрезвычайной использовать разрешения и фаст трек статус, выявления вирусной РНК обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует инструментария, обучение пользователей, и значительные пробоподготовки. Таким образом они должны быть отправлены в «утвержденных» эталонных лабораторий, требует времени. Действительно, в августе 2016, центр по контролю за заболеваниями (CDC) спрашивал беременных женщин которые были укусил комар и разработал Зика показывая сыпь ждать неприемлемым 2 до 4 недель до обучения, ли они были инфицированы. Нам очень нужны тесты, которые можно сделать на сайте, с мало ресурсов и подготовленных, но не обязательно лицензированным персоналом.
Это видео демонстрирует assay который удовлетворяет эти спецификации, работа с мочой или сыворотки (для пациентов) или щебень комаров туши (для экологического наблюдения), все без много пробоподготовки. Комаров тушки фиксируются на бумаге, перевозящих четвертичных аммониевых групп (Q-бумага) следуют аммиака лечения для управления биологической опасности. Эти затем непосредственно, без изоляции РНК, помещаются в Пробирной пробирки, содержащие лиофилизированной реагенты, которые нужно не цепи охлаждения. Изменение формы обратной транскрипции цикла опосредованной изотермической амплификация с целевой объект специфического дневно тегами переносные датчики производит индикация, в 30 мин, как сигнал трехцветной флуоресценции. Это визуализируется с КПК, аккумуляторный устройство с фильтром оранжевый. Форвард загрязнение предотвращается с герметичных труб и использование термолабильных урацила ДНК glycosylase (ПХГ) в присутствии dUTP в смеси амплификации.
Introduction
Москиты вирусных инфекций, включая денге и чикунгунья Зика вирусы находятся на стратегии немедленного управления ростом и спросом. Денге и чикунгунья вирусы уже являются эндемичными во многих тропических регионах, где Зика сейчас распространяется в Западном полушарии1. Зика вирус, как лихорадка денге, является членом семейства Flaviviridae и родной Африке с одной азиатской и два африканских генетических линий2. Даже несмотря на то, что выявление вируса Зика восходит к 1947, Зика инфекции в организме человека оставалась спорадические за полвека до возникающих в Тихоокеанском регионе и в Америке. Первая вспышка сообщил Зика, лихорадка произошло на острове Яп Федеративных Штатов Микронезии в 2007 году, затем Французской Полинезии в 2013 и 2014. Первая крупная вспышка в Америке произошло в 2015 году в Бразилии.
Зика, чикунгуньи и денге вирусы передаются главным образом Aedes aegypti и Aedes albopictus. Однако Зика имеет возможности дополнительных течению передачи от человека, скорее всего распространяются через половой контакт, мать плод взаимодействия и через кормление грудью3,4,5. Зика лихорадка была впервые считается, вызывают только легкую форму заболевания. Однако, позже он стал связанных с синдром Гийена-Барре в взрослых, микроцефалия в новорожденных и хронических заболеваний опорно-двигательного аппарата, которые могут последних месяцев до лет. Диагноз болезни Зика может быть сложным, так как симптомы инфекции Зика, аналогичны другим комаров распространение вирусов6. Общие коинфекций этих вирусов сделать дифференциальный диагноз, даже более сложной,7,8. Таким образом быстрое и надежное обнаружение нуклеиновых кислот от Зика и других вирусов необходима для понимания эпидемиологии в режиме реального времени, начать контроля и превентивных мер, а также управлять ухода за пациентами9.
Текущий диагностические тесты для этих вирусов включают серологических тестов, изоляции вируса, вирус последовательности и реверс транскрипция ПЦР (RT-PCR). Стандартные серологические подходы часто страдают от недостаточной чувствительности и результатов может быть осложнено перекрестной реактивности у больных, которые ранее были заражены другими flaviviruses.
Таким образом тестирование нуклеиновой кислоты остается наиболее надежным способом обнаруживать и различать эти вирусы. Обнаружение Зика и других вирусов, переносимых комарами обычно выполняется с помощью ПЦР- или RT-ПЦР в реальном времени в различных биологических жидкостях, например сыворотки крови, мочи, слюны, Семен, грудное молоко и мозговой жидкости10,11. Пробы мочи и слюны предпочтительней как правило крови, так как они обладают менее ПЦР ингибирование, высоких вирусных нагрузок, присутствие вирусов на более длительные периоды времени и увеличение облегчения сбора и обработки12,13. Диагностические тесты, основанные на RT-PCR, однако, включают действия по подготовке обширной выборки и дорогих термического Велоспорт оборудования, что делает его менее оптимальных для точки обслуживания.
Обратная транскрипция, петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) стала мощной альтернативой RT-PCR из-за его высокой чувствительности и специфичности14, его терпимость ингибирующих веществ в биологических образцов15, и операция на одной температуры, что значительно снижает пробирного сложность и связанные с этим расходы, что делает его пригодным для ограниченных ресурсов сред. RT-лампа, классически реализованное состоит из шести грунты, которые связывают с восьми различных регионов в рамках целевого РНК. Он запускается при постоянной температуре от 60 ° C до 70 ° C и использует обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы с сильным нити, вытесняя деятельности.
На начальных этапах RT-лампа вперед и назад внутренней грунтовки (МФП и BIP, рис. 1A) наряду с внешней вперед и назад грунтовки (F3 и B3) образуют структуру Гантель, семя структура экспоненциального Усилительная лампа. Результаты в формировании concatemers с несколькими повторяющимися циклы16, и усиления далее ускорить цикл вперед и назад грунтовки (LF и LB), которые предназначены для связывания одного мель регионах Гантель. Классическая LAMP assays зависимости мутности или индикации ДНК, интеркалирующие красители не совсем подходит для обслуживания точки обнаружения Зика, где некоторый уровень мультиплексирования является желаемой17,18,19. Мультиплексирование не получается легко в этих системах, поскольку они склонны к генерации ложных срабатываний из-за уточнениями пробить.
Чтобы управлять этими вопросами, литературе добавляет дополнительный компонент в виде «Стрэнд вытесняя зонд» классическая RT-лампа архитектуры20,21,22. Каждый датчик имеет последовательность специфичных двухручьевой региона и региона одноцепочечной грунтовки. Зонд с регионом одноцепочечной маркирован с 5′-Флюорофор, и дополнительных зондов изменяется с 3′-конце утоления. В отсутствие целевого объекта не флуоресценции наблюдается за счет гибридизации взаимодополняющих зонд нитей, который приносит Флюорофор и утоления в непосредственной близости. При наличии цели одноцепочечной части флуоресцентного зонда связывается с его дополнением на цель и затем продлен на прядь, вытесняя полимеразы. Дальнейшее расширение полимеразы на обратный грунтовки причины разъединения утоления прядь от его взаимодополняющих дневно обозначенные strand, позволяя выбросов флуоресценцииРисунок 1B) (). С этой конструкции сигнал генерируется после формирования Гантель, уменьшая шансы ложных сигналов.
Double-stranded часть зонд прядь вытесняя может быть любой последовательностью, и когда применяется мультиплексирование, та же последовательность может использоваться с различными Флюорофор утоления парами. С этой архитектуры, загрязненных вирусом мочи, сыворотки или комаров образцы сплющенным на бумаге непосредственно были введены в assay без предварительной подготовки образца. Трехцветная флуоресценции read-outs видна человеческому глазу были получены в течение 30-45 мин, и сигналы были визуализированное окно 3D-печати наблюдения, которое использует синий светодиод и оранжевый фильтр. Паром для лиофильной сушки реагенты RT-лампа включена развертывания этого комплекта для снижения параметров ресурсов без необходимости охлаждения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Москиты вирусов, включая Зика, чикунгуньи и денге угрожают общественного здравоохранения и недавние вспышки голы Зика потребность в лоу кост обслуживания точки обнаружения альтернатив для диагностики пациентов, а также для наблюдения комаров. Изотермическая амплификация методы были…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа частично поддержали FDOH-7ZK15 и NIAID 1R21AI128188-01. Исследования в этой публикации было поддержано в части национальных институтов аллергии и инфекционных заболеваний и в части биомедицинских исследований программы из Флорида Департамента здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения низ или Флорида Департамента здравоохранения. Динамический Комбинаториальная химия ООО признается за их поддержку и вклад в этот проект.
Вирус денге 1 (штамм Бол-KW010) был любезно представил Флорида Департамент здравоохранения бюро лабораторий. Зика вирус и азиатских lineage вирус чикунгуньи любезно предоставил центрами по контролю и профилактике заболеваний. Индийского океана lineage вирус чикунгуньи была любезно предоставленных Роберт Теш (Всемирный консультационный центр для новых вирусов и арбовирусов, через университет Техаса Медицинское отделение в Галвестон, штат Техас) для UF-FMEL. Мы благодарим S. Беллами, B. Истмонд, S. Ортис, D. Велес, K. Уиггинс, р. ZimLer и K. Zirbel за помощь с исследованиями инфекции. Мы также благодарим м. S. Ким за предоставление Q-бумаги.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
Riferimenti
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
