Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı
Summary
Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.
Abstract
Zika, Dang ve chikungunya virüs hastalıklar ile benzer hasta belirtilere neden sivrisinekler tarafından iletilir. Ancak, onlar farklı akış aşağı hastaya iletim potansiyelleri var ve çok farklı hasta tedavi gerektirir. Böylece, son Zika salgınlar acil hızla bu virüsler hastalarda ayırımcılık araçları geliştirmek için yapmak ve doğru hasta tedavi seçin ve anlamak ve onların gerçek zamanlı Epidemiyoloji yönetmek için Sivrisinek, tuzağa.
Ne yazık ki, bu alıcı 2016 acil durum da dahil olmak üzere geçerli tanı sınamaları yetkilerini kullanmak ve hızlandırılmış durumu, viral RNA ters transkripsiyon Polimeraz zincir araçları gerektiren tepkimesi (RT-PCR), tarafından eğitilmiş kullanıcılar, algılamak ve önemli numune hazırlama. Böylece, onlar süresi gerektiren “onaylanmış” referans laboratuvarlar için gönderilmesi gerekir. Gerçekten de, Ağustos 2016 yılında Merkezi hastalık kontrolü (CDC) için hamile kadınlar kim olduğunu soruyordu bir sivrisinek tarafından ısırılmış ve onlar enfekte olup olmadığını öğrenme önce kabul edilemez bir 2-4 hafta beklemeni Zika gösteren kurdeşen. Sitede, az kaynak ile eğitimli ama mutlaka lisanslı personel tarafından yapılabilir testler çok ihtiyacımız var.
Bu video tüm fazla numune hazırlama idrar veya serum (için hastalar) veya ezilmiş sivrisinek leşleri (için çevre gözetim), çalışma bu belirlemelerini karşılar bir tahlil göstermektedir. Sivrisinek leşleri biyolojik yönetmek için kuaterner amonyum grubu (Q-kağıt) tarafından amonyak tedavi takip taşıyan kağıda yakalanır. Bunlar daha sonra doğrudan, RNA izolasyon, soğutma yok zinciri gerek dondurularak reaktifler içeren tahlil tüpler içine konur. Değiştirilmiş bir form ile ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon hedef özgü fluorescently etiketli displaceable probları ile okuma, 30 dk, üç renkli floresan sinyali olarak üretir. Bu bir turuncu filtre ile bir el, pilli cihaz ile görüntülenir. İleri kirlenme kapalı tüpler ve thermolabile urasil DNA glycosylase (UDG) huzurunda dUTP amplifikasyon karışımı kullanımı engellenir.
Introduction
Sivrisinek yoluyla bulaşan virüs enfeksiyonları, Dang, chikungunya ve Zika virüsler de dahil olmak üzere yükselişi ve isteğe bağlı Acil Yönetim Stratejileri vardır. Dang ve chikungunya virüs zaten endemik birçok tropikal bölgelerin nerede Zika şimdi Batı Yarımküre1yayılıyor. Zika virüs, Dang gibi Flaviviridae ailesinin üyesi olan ve bir Asya ve iki Afrika genetik soy2ile Afrika’e. Zika virüs tanımlaması geri 1947 için Tarih rağmen Pasifik ve Amerika’nın ortaya çıkan önce yarım yüzyıl için Zika enfeksiyon insanlarda, tek tük kaldı. 2007’de, Mikronezya Federal Devletleri Yap Adası üzerinde ateş oluştu Zika ilk bildirilen patlak 2013 ve 2014 Fransız Polinezyası tarafından takip ettim. Amerika’nın ilk büyük patlak 2015 yılında Brezilya’da oluştu.
Zika, chikungunya ve dang virüs öncelikle Aedes aegypti ve Aedes albopictustarafından iletilir. Ancak, Zika ek aşağı akım insandan insana iletim olanakları, büyük olasılıkla anne fetus etkileşim, cinsel temas yoluyla ve3,4,5emzirme yoluyla yaymak vardır. Zika ateş ilk sadece hafif hastalığa neden inanılıyordu. Ancak, daha sonra Yetişkin Guillain-Barré Sendromu, microcephaly Yenidoğan Bebeklerin ve yıl için geçen ay olabilir Kronik kas-iskelet hastalıkları ile ilişkili. Zika Enfeksiyon belirtileri bu diğer sivrisinek-yayılan virüs6benzer beri Zika hastalık tanısında, zor olabilir. Bu virüslerin ortak işbirliği enfeksiyonlar ayırıcı tanı daha da zorlu7,8olun. Bu nedenle, hızlı ve güvenilir Zika ve diğer virüs nükleik asitlerden tespiti Epidemiyoloji gerçek zamanlı olarak kontrol ve önleyici tedbirler başlatmak ve hasta bakımı9yönetmek için anlamak için gereklidir.
Bu virüsler için geçerli tanı sınamaları serolojik testler, virüs yalıtım, virüs sıralama ve ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) içerir. Standart serolojik yaklaşımlar genellikle yetersiz hassasiyeti muzdarip ve sonuçları olan daha önce diğer flaviviruses tarafından enfekte hastalarda tarafından karmaşık.
Bu nedenle, nükleik asit test algılamak ve bu virüsler ayırt etmek için en güvenilir yol kalır. Zika ve diğer sivrisinek yoluyla bulaşan virüs algılama genellikle RT-PCR ya da gerçek zamanlı RT-PCR biyolojik sıvıları, serum, idrar, tükürük, meni, anne sütü ve serebral sıvı10,11gibi çeşitli kullanılarak gerçekleştirilir. Onlar sergi beri daha az PCR-inhibisyon, daha yüksek viral yük, virüs varlığı daha uzun süreler ve artan koleksiyonu ve12,13Taşıma kolaylığı için idrar ve tükürük örnekleri üzerinde kan, genellikle tercih edilir. RT-PCR tabanlı tanı testleri ancak, kapsamlı örnek hazırlık adımları ve daha az bakım noktası için en iyi yapmak pahalı termal Bisiklete binme ekipman oluştururlar.
Ters transkripsiyon izotermal amplifikasyon (RT-lamba) döngü-aracılı yüksek duyarlılık ve özgüllük14nedeniyle güçlü bir RT-PCR alternatif olarak ortaya çıkmıştır, onun dayanıklılık için inhibitör maddelerin biyolojik örnekleri15, ve önemli ölçüde düşürür karmaşıklığı ve ilgili maliyetler, düşük kaynak ortamları için uygun hale tahlil tek sıcaklık işlem. Klasik uygulandığı gibi RT-lamba, sekiz farklı bölgelere hedef RNA içinde bind altı astar oluşmaktadır. 60 ve 70 ° C arasında sabit sıcaklıklarda çalışır ve bir ters transkriptaz ve DNA polimeraz güçlü strand etkinlik yerinden kullanır.
RT-lamba ilk aşamalarında, ileriye ve geriye doğru iç astar (FIP ve BIP, şekil 1A) dış ileriye ve geriye doğru astar (F3 ve B3) ile birlikte bir dumbbell yapısı, üstel lamba amplifikasyon tohum yapısını oluştururlar. Amplifikasyon daha da halter tek telli bölgelerinde bağlamak için tasarlanmış olan döngü ileriye ve geriye doğru astar tarafından (Eğer ve LB), hızlandırılmış ve birden fazla tekrarlayan olan concatemers oluşumu sonuçlarında döngüler16. Klasik lamba dayalı bulanıklık deneyleri veya17,18,19Zika çoğullama bazı düzeyde nerede, bakım nokta tespiti istenen okuma boyalar enterkalasyon DNA tarafından tamamen uygun değildir. Yanlış-mutlak hedef kapalı Arttırımlar nedeniyle oluşturmak eğilimli oldukları gibi çoğullama kolayca bu sistemlerinde alınır değil.
Bu sorunları yönetmek için edebiyat klasik RT-lamba mimari20,21,22‘ ye bir “strand yerini değiştirerek sonda” şeklinde başka bir bileşen ekler. Her sonda fingerprinting iki iplikçikli bölge ve bir tek iplikçikli astar bölgesi vardır. Sonda ile tek iplikçikli bölge bir 5′-fluorophore ile etiketlenir ve tamamlayıcı sonda 3’ uç içki ile değiştirilir. Bir hedef olmaması durumunda, fluorophore ve içki yakın getiren hibridizasyon tamamlayıcı sonda iplikçiklerinin nedeniyle hiçbir Floresans görülmektedir. Bir hedef huzurunda floresan sonda tek iplikçikli bölümünü hedef, tamamlayıcı bağlar ve sonra polimeraz yerinden bir iplikçik tarafından genişletilmiş. Daha fazla polimeraz uzantısı ters astar tarafından içki Strand Floresan ()şekil 1B)emisyon izin onun fluorescently etiketli iplikçik, gelen ayrılma nedenleri. Bu tasarım ile sinyal yanlış sinyalleri şansını azaltır dumbbell oluşumu sonra oluşturulur.
Strand yerini değiştirerek sonda çift iplikçikli bölümü herhangi bir sıra olabilir ve çoğullama uygulandığında, aynı sıra farklı fluorophore-içki çiftleri ile kullanılabilir. Bu mimari, virüs bulaşmış idrar, serum veya sivrisinek ile kağıt üzerinde squished örnekleri doğrudan örnek hazırlık yapmadan tahlil tanıtıldı. Üç renkli floresan okuma insan gözüyle 30-45 dk içinde oluşturulan ve sinyalleri bir mavi LED ve turuncu bir filtre kullanan bir 3D baskılı gözlem kutusunun tarafından görüntülenmiştir. RT-lamba reaktifler dağılması soğutma gerek olmadan kaynak ayarları düşürmek için bu kit dağıtımını etkin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sivrisinek kaynaklı virüsler Zika, chikungunya ve dang gibi halk sağlığı ve son Zika salgınlar vurgulamak için düşük maliyetli bakım noktası algılama alternatifler sivrisinek gözetim yanı sıra hasta tanıları için ihtiyaç tehdit. İzotermal güçlendirme yöntemleri PCR tabanlı sistemler uygun fiyatlı alternatif olarak geliştirilmiştir. Özellikle, RT-lamba-temel platformlar çok çeşitli patojenler algılamak için uygulandı. Ancak, izotermal platformlar kullanımı tek hedef tespit için esas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma kısmen FDOH-7ZK15 ve NIAID 1R21AI128188-01 tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırma kısmen ve kısmen Biyomedikal Araştırma programı, Florida Sağlık Bakanlığı Ulusal kurumları alerji ve enfeksiyon hastalıkları tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH veya Florida Sağlık Bakanlığı resmi görüşlerini temsil etmiyor. Dinamik Kombinatorik kimya LLC bu projeye katkısı ve desteği için kabul edilmektedir.
Dang 1 virüs (zorlanma BOL-KW010) Florida bölümü, Sağlık Bürosu tarafından laboratuarlar sağlanan lütfen. Nezaketle Zika virüs ve chikungunya virüsü Asya soyundan tarafından Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme için verilmiştir. Chikungunya virüsü ve Hint Okyanusu soyundan, UF-FMEL için lütfen Robert Tesh (ortaya çıkan virüs ve Arboviruses, Galveston, Texas Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi aracılığıyla dünya başvuru Merkezi) tarafından sağlandı. S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, ö. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer ve K. Zirbel enfeksiyon çalışmaları ile yardım için teşekkür. Biz de M. S. Kim Q-kağıt verdiğiniz için teşekkür ederiz.
Materials
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
Riferimenti
- Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
- Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
- Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
- Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
- Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
- Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
- Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
- Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
- Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
- Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
- Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
- Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
- Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
- Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
- Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
- Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
- Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
- Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
- Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
- Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
- Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
- Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
- Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
- Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
- Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
- Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
- Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).
