Um protocolo para a extração de um acompanhante de metal de transição periplasmático no contexto dos seus parceiros de ligação nativo e caracterização Biofísica de seu conteúdo de substrato por raios-x, absorção fluorescência e radiometal é apresentada.
Vamos demonstrar um método dimensionável para a separação entre o periplasm bacteriana do citoplasma. Este método é usado para purificar a proteína periplasmático para efeitos de caracterização biofísica e transferência de substrato medida entre compartimentos citoplasmáticos e periplasmático. Cuidadosamente limitando o tempo que o periplasm é separado do citoplasma, o experimentador pode extrair a proteína de interesse e ensaio de cada compartimento individual para substrato sem contaminação de transição entre compartimentos. A proteína extraída de fracionamento pode ser mais analisada para determinação da estrutura tridimensional ou perfis de ligação de substrato. Como alternativa, esse método pode ser executado após a incubação com um radiotracer para determinar o total absorção por cento, bem como a distribuição do traçador (e, portanto, transporte de metal) através de diferentes compartimentos bacterianos. Experimentação com um radiotracer pode ajudar a diferenciar entre um substrato fisiológico e substrato artefactual, tais como aqueles causados por mismetallation.
Fluorescência de raio-x pode ser usada para descobrir a presença ou ausência de incorporação de metal em uma amostra, bem como medir as mudanças que podem ocorrer no metal incorporação como um produto das condições de crescimento, as condições de purificação e/ou condições de cristalização. Fluorescência de raios-x também fornece uma medida relativa de abundância para cada metal, que pode ser usado para determinar o pico de absorção de energia metal melhor usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala. Captação de radiometal pode ser usada como um método para validar a natureza fisiológica de um substrato detectado por fluorescência de raio-x, bem como apoiar a descoberta de novos substratos.
Em bactérias Gram-negativas, citoplasmáticas piscinas de átomos de metais de transição são aumentadas e alimentadas por membrana interna ABC (fita de ligação ATP) os importadores que atenuem metal translocação através da membrana interna. Periplasmático Cluster a-1 substrato proteínas de ligação (a) compõem um grupo de acompanhantes que ligam os átomos metálicos diretamente e balsa-los através do periplasm para entregá-los ao cognato ABC importadores1. Outros Clusters de apresentação são dedicadas ao transporte de substratos, tais como metal quelatado (A-2 de Cluster), carboidratos (Clusters B e D-1) e aminoácidos (grupos B, C, F-2 e F-4); no entanto, independentemente do substrato, a segue um conservado evolutivamente pinça dobra2. O mecanismo proposto generalizado para transferência de substrato SBP inclui a pinça passando por uma série de contorções que se assemelham a uma planta carnívora3. Geralmente, Cluster a-1 a purifica em um formulário de holo (metal-limite), embora o estudo destes apresentação é limitado pela dificuldade em gerar apo (metal-free) formas de proteína para experimentação4. Até à data, estratégias para estudar apo Cluster a-1 foram limitados ao mutagênese, diálise e desnaturação parcial com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) do ácido quelante5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. dados estruturais provenientes dessas experiências sugerem que Cluster a-1 apresentação não pode seguir precisamente o mecanismo de planta carnívora. Atualmente falta da literatura é um método de produção de apo a-1 a Cluster na vivo usando parceiros de ligação fisiológica.
Nós demonstramos pela primeira vez usando o fracionamento celular para purificar YfeA, um Cluster a-1 SBP da Yersinia pestis, agente etiológico da peste, que foi convertido ao formulário apo através da interação com o seu importador cognato fisiológica do ABC YfeBCDE na célula. Mostramos que a YfeA é a forma de apo por espectroscopia de raio-x-energia dispersiva (EDS), também conhecido como fluorescência de raio-x. Também demonstramos a funcionalidade YfeBCDE combinando fracionamento celular com estudos de absorção de metal radioativo altamente sensível para distinguir entre absorção através da membrana exterior de metal e metal importação através da membrana interna. O uso de um dispositivo radioativo permite a detecção de quantidades de pg/L de metais, muito menores do que o limite de detecção para técnicas tais como indutivamente acoplado a espectrometria de massa de plasma (ICP-MS) ou espectroscopia de absorção atómica (AAS). Isto permite a mínima perturbação do sistema a ser estudado. Além disso, os métodos tradicionais listados muitas vezes exigem maiores volumes de amostra, adicional pós-processamento e tempos mais longos reviravolta, que não são típicos para ensaios radiotracer. Assim, usar um radiotracer fornece um método conveniente e simples para monitorar a distribuição de metal e absorção dentro de uma célula. Remanesce ser determinado se uma apo a-1 SBP Cluster produzido usando esse método iria ecoar as observações estruturais de práticas correntes usadas para gerar proteínas apo.
Fracionamento celular é um método estabelecido para a separação de compartimentos celulares para o propósito implícito de sondagem especificamente seu conteúdo em isolamento12. Fracionamento celular é comumente usado para confirmar a localização de uma molécula durante o ciclo celular ou medir a atividade de um determinado compartimento13. Por exemplo, atividade de transporte de metal pode ser analisada por probing compartimentos celulares para substrato metálico. Integração do fracionamento celular permite distinção e comparação entre metal absorção através da membrana externa e transferência de metal através da membrana interna. Estes processos então por sua vez podem ser medidos ao longo do tempo. No caso de purificação de proteínas, os métodos mais comuns de lise celular e separação de componentes solúveis de componentes insolúveis são ruptura mecânica (ou seja, moagem, mistura), homogeneização de alta pressão (ou seja, imprensa de célula de pressão francesa, celular disruptor) e frequências ultra-sônicas (i. e., sonication)14. Uso de frequências ultra-sônicas para lyse pilhas geralmente é mais adequado para pequenos volumes; no entanto, sonication é conhecido para gerar calor excessivo que pode desnaturar proteínas. Para evitar a geração de calor excessivo, frequências ultra-sônicas são normalmente aplicadas em rajadas curtas sequenciais, que podem ser demorado e inadvertidamente degradar as moléculas de DNA em fragmentos menores. Além disso, várias sondas sonication caro podem ser necessárias para experimentos preparativa e analíticos, como cada sonda tem um alcance limitado para o volume de amostra que pode ser processado. Uso de alta pressão para lyse pilhas evita gerar calor excessivo durante a lise celular por componentes de imprensa francesa pressão célula antes da lise de refrigeração ou operando um disruptor de células em um ambiente frio, como uma sala fria. Como sondas sonication, vários conjuntos de componentes de imprensa francesa pressão célula podem precisar de ser comprados para processar uma vasta gama de volumes de amostra. Imprensa de célula de pressão francês assemblies são fáceis de se conectar mas complicado de operar e limpar, pode ser pesada para se mover e são propensa ao entupimento das amostras densas. Vantagens em usar frequências ultra-sônicas e sistemas de alta pressão para lyse pilhas incluem recuperação de amostra alta, capacidade de processar várias amostras com contaminação mínima, e ajustável, força de cisalhamento, o que pode ser adaptado para otimização de lise de uma ampla gama de tipos de amostra. Otimização pode ocorrer, ajustando a frequência ultra-sônica, duração de rajadas, pistão pressão de libras por polegada quadrada (psi) e o número de passes através da imprensa. Uso de ruptura mecânica para lyse pilhas pode ser a estratégia mais tècnica trivial e menos cara para lise celular. Ruptura mecânica pode apresentar desafios na recuperação de amostra e não é o ideal para o processamento de amostras múltiplas. Ruptura mecânica é mais suave para amostras de alta pressão ou frequências ultra-sônicas, mas não é alto throughput e é propensa a Lise ineficiente. Uma significativa limitação experimental de ruptura mecânica, homogeneização de alta pressão e frequências ultra-sônicas, é o rompimento incontrolável da arquitetura celular inteiro tal que após a Lise, todos os componentes da célula aquosa são misturados juntos. Além disso, todos os compartimentos da célula não perturbem ao mesmo tempo; Portanto, conteúdo de compartimentos que lyse cedo pode ser sujeito a forças disruptivas em curso mais de conteúdo de compartimentos que lyse tarde. Fracionamento celular permite tecnicamente simples, barata e eficiente separação baseada no compartimento a de conteúdo da célula, evitando a necessidade de equipamento caro e exposição de amostra para forças duras, sem interrupções.
No caso da SBP, substrato importado é reintroduzido para potencialmente apo proteína e regenera holo proteína durante Lise, antes da cromatografia a jusante ou outras técnicas de purificação. Inclusão de quelante EDTA durante lise apresenta um obstáculo adicional, onde a afinidade de metal como uma primeira etapa de purificação de proteínas não é possível porque EDTA irá tira de metal a partir da resina de cromatografia e evitar a proteína ligando15. Uma solução simples e barata é fracionamento celular por choque osmótica, onde centrifugação diferencial e reagentes comuns de laboratório permitem que o investigador cuidadosamente extrair proteínas suficientes para análise funcional. Fracionamento de choque osmotic utiliza uma mudança de duas etapas na pressão osmótica para separar compartimentos celulares. Em primeiro lugar, um buffer hipertônico faz com que células de Crate como água deixa cada célula e em segundo lugar, um buffer hipotônica faz com que células a inchar como água re-entra em cada célula. Controlando cuidadosamente quanto tempo as células incham, as membranas externas podem ser seletivamente lysed (devido ao acúmulo de pressão osmótica da água entrante), assim, esvaziando seu conteúdo para o buffer. Preservação das membranas internas garante que o conteúdo citoplasmático é retido em spheroplasts e é facilmente separado da periplasmático conteúdo por centrifugação.
YfeA é um poli-específica capaz de ligação de ferro, manganês e zinco átomos16SBP. As proporções relativas de metal incorporado pode ser alterado de acordo com o metal suplementação durante o crescimento e analisada por fluorescência de raio-x como está disponíveis no Advanced Photon Source16 do Laboratório Nacional Argonne. Fluorescência de raio-x permite que o investigador para perfil rapidamente um conjunto amplo de metais sem a necessidade de grandes ou cristais de qualidade de difração e nem pode recolher dados de solução de proteína precipitado ou proteicas.
Fluorescência de raio-x pode rapidamente revelar resultados inesperados tais como, neste caso, o principal substrato de YfeA sendo o zinco e não os substratos fisiológicos documentado ferro ou manganês16. Se usado antes de coletar dados de espalhamento de raios-x, fluorescência de raio-x pode informar o investigador no delineamento experimental, como que energia metal arestas para usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala. Só tão útil como determinar a abundância relativa de uma metal, fluorescência de raios-x também pode determinar se um metal está ausente em uma amostra, fornecendo um método rápido de separar os cristais do metal contendo apo proteína da proteína holo e estimar a força do sinal sem a necessidade de demorado de processamento de dados. Após identificar uma amostra com um sinal forte do metal, o comprimento de onda preciso usar para coleta de dados de espalhamento de raios-x anômala pode ser determinado pela verificação de múltiplos comprimentos de onda de dispersão anômala (MAD).
Este protocolo detalhado destina-se a ajudar novos experimentadores com sucesso realizar fracionamento celular e fazer o uso eficaz de hardware de trajetória síncrotron perfil total teor de metais e promover o estudo de proteínas de ligação de metal.
Fracionamento celular é uma ferramenta útil para sondagem especificamente o conteúdo de um compartimento celular e pode servir como uma ferramenta útil para extrair pequenas moléculas como átomos metálicos, bem como macromoléculas como proteínas. É interessante notar que fracionamento celular não é uma técnica absoluta e pode ser propenso sem atenção cuidadosa a ressuspensão/mistura, temperatura de incubação e tempo de incubação. Mistura incompleta pode resultar no mínima lise membranosa e fracionamento assim negligenciável, fracionamento em temperatura ambiente pode causar rápida lise de ambas as membranas, resultando em contaminação da fração periplasmático com conteúdos citoplasmáticos, e tempos de incubação prolongado também podem resultar em lise excessiva e, portanto, a contaminação de fração. Um compromisso razoável para a realização da lise de membrana externa eficiente e relativamente completo (preservando a membrana interna) é incubação 20 minutos sobre o gelo no buffer de fracionamento hipotônica. Outra consideração é o método de extração, onde dura extração sacudindo ou vórtice pode comprometer a qualidade do extrato como causando a agregação da proteína. É aconselhável misturar suavemente como espátula, inversão ou por aspiração com uma pipeta para manter o material de alta qualidade para análise a jusante. Purificação de fracionamento celular preparativa pode ocorrer com eficiência variável, como evidenciado pela Figura 1. Em um experimento, YfeA começou como 8% do conteúdo periplasmático extraído (Figura 1), enquanto em outro experimento, YfeA começou como 17% do conteúdo periplasmático (Figura 1). Estas diferenças podem surgir de várias razões, tais como condições de expressão variável (adição de EDTA para a mídia de crescimento pode aumentar a expressão dos genes regulados por mecanismos de fome como regulamento de peles do promotor Yfe), o uso repetido do congelado ações permanentes e erro humano. Em vez de ajustar os tempos de incubação, é aconselhável aumentar a preparação. Purificação da fracção periplasm recomenda-se incluir uma eluição gradiente linear da etapa cromatográfica de troca de ânion. Eluição de gradiente um passo é uma estratégia de eluição as utilizações discretas e abrupto alterações na composição da fase móvel (i. e., 0 mM NaCl, 50mm NaCl, 150 mM NaCl, etc.). Uma eluição gradiente linear é uma estratégia de eluição que usa a mudança gradual no mobile fase composição (isto é, 0 mM de NaCl, 5 mM de NaCl, 10 mM de NaCl, etc.). Um gradiente de etapa é útil para a separação de moléculas que têm afinidades diferentes para a fase estacionária, e uma eluição gradiente linear é útil para a separação de moléculas que têm afinidades semelhantes para a fase estacionária. No caso de purificação da proteína sem etiqueta de purificação artificial (para aumentar a afinidade com a fase estacionária), de um compartimento da célula que é rico em proteínas únicas espécies, recomenda-se uma eluição gradiente linear para separar proteínas de noninterest que podem têm afinidades semelhantes à fase estacionária, como a proteína de interesse. Geralmente, um rendimento de 1-2 mg de purificado apo YfeA é esperado de cada litro de cultura expressando YfeA de seu endógeno Y. pestis promotor.
Fluorescência de raios-x é uma técnica que permite que o investigador rapidamente determinar o teor de metais em uma amostra, e informar o investigador sobre incorporação de metal inesperada que seria desconhecida. Embora o EDTA é incluído no buffer de fracionamento hipertônica para remover o metal livre ou vagamente associada, YfeA derivado da fração periplasm pode conter algumas proteínas holo. Dado que o transporte de metal é um processo dinâmico, talvez o conteúdo de proteína de holo origina YfeA que ainda não doou sua carga para YfeBCDE. É interessante notar que a fluorescência de raio-x apenas mede o teor total de metal e não indica se o metal é ordenado em um lattice de cristal, ou especificamente ligado a uma proteína. Para determinar se metal é ordenado em um lattice de cristal e/ou especificamente ligada a uma molécula de proteína, processamento e coleta de dados de espalhamento de raios-x é necessário. Não obstante, fluorescência de raio-x permite a avaliação rápida amostra da contaminação de metal e/ou integração de proteína residual holo. Radiação síncrotron tempo é limitado e nem sempre há tempo para elaborar uma estratégia para a coleta de dados de espalhamento de raios-x em cada amostra, assim a fluorescência de raios-x é uma técnica valiosa para a seleção de muitos cristais e priorizando para que amostras de raio-x devem ser recolhidos dados de dispersão. Além disso, fluorescência de raio-x permite a coleta de dados de amostras que podem não difração de raios-x. Ao coletar dados de fluorescência de raios-x, às vezes o sinal pode ser muito fraco e o espectro resultante uninformative. Para melhorar a força do sinal, para fluorescência de raio-x ou varredura louco, considere aumentar o tempo de exposição e/ou diminuindo a atenuação do feixe de raios-x. Quando uma amostra é identificada para a coleta de dados de espalhamento de raios-x, recomenda-se coletar dados de espalhamento de raios-x em uma parte diferente da amostra do que foi usado para fluorescência de raio-x e MAD digitalização para minimizar os danos de radiação, melhorar a qualidade dos dados coleção e minimizar qualquer potencial de redução do sinal anômalo.
Detecção de traçadores radioativos exige quantidades nanomolar de material ou menos, e o uso destes marcadores como agentes de rastreamento molecular fornece um método simples e altamente sensível de sondagem processos celulares. O ensaio de radiometal descrito acima pode ser usado para determinar a absorção de metal total, distribuídos por compartimentos celulares, bem como taxas de absorção. De fato, cada ponto de tempo de dados requer um fracionamento de 40 minutos; no entanto, como cada ponto de tempo for atingido, células são imediatamente peletizadas e incubadas em tampão de sal elevado (Figura 5etapa 1). Radiometal medições da mídia, Descartado buffer de sal elevado (Figura 5etapa 1) e frações periplasmático e citoplasmáticas depois (Figura 5etapa 3) indicam que a incubação alta reserva de sal com êxito remove todos os restante não associado gratuito metal que demorou-se após a centrifugação inicial depois de atingir o ponto de tempo. A centrifugação inicial remove a maioria (até 80%) do metal livre não associado e a centrifugação após incubação no buffer de sal alta também remove adicional restante metal de graça não associado. Qualquer metal de graça não associado persistente não deverá influenciar significativamente o transporte de metal durante o fracionamento de 40 minutos. A influência do fracionamento de 40 minutos no transporte intracelular de metal é uma outra consideração para interpretação dos dados de prudente. Praticamente o protocolo inteiro fracionamento ocorre sobre o gelo, além da centrifugação 30 segundo entre as etapas. Tempo de transporte experimentos curso indicaram que mantém as células a 4 ° C revoga transporte metal20,21,22; de metal Portanto, porque os experimentos ocorre sobre o gelo, o fracionamento de 40 minutos não é esperado para aumentar significativamente os níveis de metal no periplasm do citoplasma e os níveis de metal são esperados para ser representante de pontos de tempo no qual as células foram Inicialmente, centrifugalized.
Determinação da absorção relativa em diferentes compartimentos celulares pode ajudar a informar dados XFS, corroborar a natureza fisiológica de um substrato, bem como habilitar o investigador a sonda ainda mais os detalhes moleculares de um mecanismo. Por exemplo, adição de mutagénese genética para experimentos de captação radiometal fornece um método direto para reforçar os principais resíduos funcionais ou moléculas envolvidas no transporte do substrato. Vantagens de análises e experiências de captação radiometal incluem rápida reviravolta, alta produtividade, alta reprodutibilidade e paralelização de experimentos comparando as condições de crescimento e construções genéticas.
The authors have nothing to disclose.
Também foram recolhidos em GM/CA@APS, que tem sido financiado no todo ou em parte com recursos federais do Instituto Nacional de câncer (ACB-12002) e o Instituto Nacional de General Medical Ciências (AGM-12006). Esta pesquisa utilizou recursos de fonte de fóton avançada (APS), uma facilidade do Estados Unidos Departamento de energia (DOE) escritório de ciência usuário operado para o escritório da ciência DOE, pelo Laboratório Nacional Argonne, sob contrato n º DE-AC02-06CH11357. Uso da fonte de fótons avançada foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas, sob contrato n º W-31-109-Eng-38.
Nós gostaríamos de reconhecer a UAB Comprehensive Cancer Center – facilidade de compartilhado Proteomics/espectrometria de massa (P30CA13148-38), por sua assistência na análise de espectrometria de massa.
CdR foi apoiado por uma bolsa da Universidade do Alabama em Birmingham escritório de diversidade, equidade e inclusão. L.L.R. foi apoiado pelo departamento de Radiologia da Universidade de Alabama em Birmingham. O departamento de energia, escritório de ciência, isótopo programa suportado 52produção Mn e A.V.F.M. sob concessão DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |