Un protocolo para la extracción de una chaperona de periplasmic metales de transición en el contexto de sus socios de Unión nativos y caracterización biofísica de su contenido de sustrato mediante rayos x se presenta absorción fluorescencia y radiometal.
Demostrar un método escalable para la separación del periplasma bacteriano del citoplasma. Este método se utiliza para purificar la proteína periplasmic con fines de caracterización Biofísica y medida sustrato transferencia entre compartimentos periplasmic y citoplásmicas. Limitando cuidadosamente el momento en que el periplasma se separado del citoplasma, el experimentador puede extraer la proteína de interés y análisis cada compartimento individual para sustrato sin contaminación remanente entre compartimientos. La proteína extraída del fraccionamiento puede entonces analizarse más para la determinación de la estructura tridimensional o perfiles de unión a sustrato. Por otra parte, este método puede realizarse después de la incubación con una radiosonda para determinar absorción por ciento total, así como la distribución del trazador (y por lo tanto metal transporte) a través de diferentes compartimentos bacterianas. Experimentación con un radiotrazador puede ayudar a diferenciar entre un sustrato fisiológico y sustrato artefactual, como los causados por mismetallation.
Fluorescencia de rayos x puede utilizarse para descubrir la presencia o ausencia de la incorporación de metal en una muestra, así como medir los cambios que pueden ocurrir en la incorporación de metal como un producto de condiciones de crecimiento, las condiciones de depuración y/o condiciones de cristalización. Fluorescencia de rayos x también proporciona una medida relativa de abundancia para cada metal, que puede utilizarse para determinar el mejor pico de absorción de energía metal a utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo. RadioMetal absorción puede utilizarse como un método para validar la naturaleza fisiológica de un substrato detectada por fluorescencia de rayos x, así como apoyar el descubrimiento de nuevos sustratos.
En bacterias Gram-negativas, piscinas citoplásmicos de los átomos de metales de transición son aumentados y reaprovisionados por Importadores de membrana interna ABC (cassette de unión a ATP) que mitigan la translocación del metal a través de la membrana interna. Periplasmic grupo a-1 sustrato proteinas (SBPs) componen un grupo de acompañantes que se unen los átomos de metal directamente y ferry por el periplasma entregar a cognado de Importadores ABC1. Otros racimos de SBPs se dedican al transporte de substratos, tales como metal quelatado (Cluster A-2), carbohidratos (grupos B y D-1) y aminoácidos (grupos B, C, F-2 y F-4); sin embargo, independientemente del sustrato, SBPs siguen una doblez de c-clamp evolutivamente conservado2. El mecanismo propuesto generalizado para la transferencia de sustrato PAS incluye la abrazadera en c en una serie de contorsiones que se asemejan a una Venus atrapamoscas3. En general, SBPs a-1 racimo purifican en una holo (metal-limite) forma, aunque el estudio de estos SBPs está limitada por la dificultad para generar apo (libre de metal) formas de proteína para experimentación4. Hasta la fecha, estrategias para el estudio de apo Cluster SBPs a-1 se han limitado a la mutagénesis, la diálisis y la desnaturalización parcial con etilendiaminotetracético (EDTA) del ácido quelante5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. datos estructurales procedentes de estos experimentos sugieren que el Cluster SBPs a-1 no puede seguir precisamente el mecanismo de la Venus atrapamoscas. Actualmente falta de la literatura es un método de producir apo SBPs a-1 grupo en vivo con socios de la Unión fisiológica.
Demostramos por primera vez mediante fraccionamiento celular para purificar YfeA, un Pas de a-1 racimo de pestis de Yersinia, el agente etiológico de la plaga, que fue convertida a la forma de apo a través de la interacción con su importador de ABC YfeBCDE cognado fisiológica en la célula. Mostramos que yfea es en la forma apo por espectroscopía de rayos x de energía dispersiva (EDS), también conocida como fluorescencia de rayos x. También demostramos YfeBCDE funcionalidad combinando fraccionamiento celular con estudios de absorción de metal radioactivos altamente sensible para distinguir entre absorción de metal a través de la membrana externa y metal importación a través de la membrana interna. El uso de un trazador radiactivo permite la detección de cantidades de pg/L de metales, mucho más bajos que el límite de detección por técnicas tales como inductivamente habían acoplada espectrometría de plasma (ICP-MS) o espectroscopia de absorción atómica (AAS). Esto permite la mínima perturbación del sistema en estudio. Además, los métodos tradicionales descritos a menudo requieren volúmenes de muestra más grandes, más post-proceso y vuelta tiempo, que no es típico para los ensayos de radiosonda. Así, utilizando un radiotrazador proporciona un método conveniente y sencillo de control de distribución de metal y absorción dentro de una célula. Queda por determinarse si un apo que SBP a-1 racimo producido con este método imprimiría las observaciones estructurales de las prácticas actuales para generar la proteína apo.
Fraccionamiento celular es un método establecido para separar compartimentos celulares con el propósito implícito de sondeo específicamente su contenido en el aislamiento12. Fraccionamiento celular es utilizado para confirmar la ubicación de una molécula durante el ciclo celular o medir la actividad de un compartimiento particular13. Por ejemplo, actividad de transporte de metal puede ensayarse mediante el sondeo de compartimentos celulares para sustrato metálico. Integración de fraccionamiento celular permite la distinción y comparación entre absorción de metal a través de la membrana externa y la transferencia de metal a través de la membrana interna. Estos procesos luego a su vez se pueden medir en el tiempo. En el caso de purificación de proteínas, los métodos más comunes de lisis celular y la separación de componentes solubles de componentes insolubles son trastornos mecánicos (molienda, mezcla), homogeneización de alta presión (es decir, prensa de la célula de presión francesa, celular disruptor) y frecuencias ultrasónicas (es decir., sonicación)14. Uso de frecuencias ultrasónicas para lyse las células generalmente es más adecuado para pequeños volúmenes; sin embargo, sonicación se conoce para generar calor excesivo que puede desnaturalizar la proteína. Para evitar generar calor excesivo, frecuencias ultrasónicas se aplican generalmente en arranques cortos secuenciales, que pueden ser desperdiciador de tiempo y sin querer degradar las moléculas de ADN en fragmentos más pequeños. Además, múltiples sondas de sonicación caro pueden ser necesarias para los experimentos preparativas y analíticos, como cada sondeo tiene un margen limitado para el volumen de muestra que pueda ser procesado. De alta presión para lyse las células evitan generar calor excesivo durante la lisis celular por refrigeración componentes de prensa de la célula de presión francesa antes de la lisis o funcionamiento un disruptor celular en un ambiente frío como el cuarto frío. Como sondas de sonicación, varios conjuntos de componentes de prensa de la célula de presión francesa deba comprar para procesar una amplia gama de volúmenes de muestra. Presión francesa celular prensa asambleas son fáciles de conectar pero torpe funcionar y limpiar, puede ser pesado para moverse y son propenso a la obstrucción de muestras densas. Ventajas al uso de frecuencias ultrasónicas y sistemas de alta presión para lyse las células incluyen recuperación muestra alta, capacidad de procesar varias muestras con contaminación mínima, y fuerza de corte ajustable, que puede ser adaptado para la optimización de la lisis de una amplia gama de tipos de muestras. Optimización puede ocurrir mediante el ajuste de la frecuencia ultrasónica, duración de ráfagas, pistón presión de libras por pulgada cuadrada (psi) y el número de pases a través de la prensa. Uso de interrupción mecánica para lisar las células puede ser la estrategia más trivial y menos costosa para la lisis celular. Interrupción mecánica puede presentar dificultades en la recuperación de la muestra y no es ideal para el procesamiento de muestras múltiples. Interrupción mecánica es más suave a las muestras de alta presión o frecuencias ultrasónicas, pero no es alto rendimiento y es propensa a lisis ineficiente. Una significativa limitación experimental de interrupción mecánica, alta presión de homogeneización y frecuencias ultrasónicas, es la perturbación incontrolable de toda la arquitectura celular tal que después de la lisis, se mezclan todos los componentes acuosos de la célula juntos. Además, todos los compartimentos de la célula no se rompen al mismo tiempo; por lo tanto, contenido de compartimientos que Lisan temprano puede ser objeto constantes fuerzas disruptivas más contenido de compartimientos que Lisan tarde. Fraccionamiento celular permite barato, técnicamente sencillo, eficiente compartimiento de separación del contenido de la celda, evitando la necesidad de equipo costoso y exposición de la muestra a fuerzas disruptivas, ásperas.
En el caso de la SBP, sustrato importado es reintroducido a potencialmente apo proteína y proteína holo regenera durante la lisis, antes de la cromatografía descendente u otras técnicas de purificación. Inclusión de quelante EDTA durante la lisis presenta un obstáculo adicional, donde metal afinidad como un primer paso de purificación de proteínas no es posible ya que EDTA se tira de metal de la resina de cromatografía y evitar la proteína vinculante15. Una solución simple y barata es fraccionamiento celular por choque osmótico, donde centrifugación diferencial y reactivos comunes de laboratorio permiten al investigador a extraer con cuidado suficiente proteína para el análisis funcional. Choque osmótico fraccionamiento utiliza un cambio de dos etapas de presión osmótica para separar compartimentos celulares. En primer lugar, un buffer hipertónico hace que las células a crenado como agua sale cada celular y en segundo lugar, un tampón hipotónico hace las células hincharse como agua vuelve a entrar en cada célula. Controlando cuidadosamente cuánto tiempo las células se hinchan, las membranas externas pueden selectivamente lisis (debido a la acumulación de presión osmótica del agua entrante), así el vaciar su contenido en el búfer. Preservación de las membranas internas asegura que el contenido citoplásmico se conserva en Esferoplastos y se separa fácilmente de periplasmic contenido por centrifugación.
YfeA es un polyspecific PAS capaz de unión de hierro, manganeso y zinc átomos16. Las proporciones relativas de metal incorporado puede ser alterado según suplementos metálicos durante el crecimiento y analizadas por fluorescencia de rayos x como en Advanced Photon Source16 del laboratorio nacional de Argonne. Fluorescencia de rayos x permite al investigador a perfil rápidamente un amplio conjunto de metales sin necesidad de grandes o difracción cristales de calidad e incluso puede recoger datos de solución proteica o precipitado de proteína.
Fluorescencia de rayos x puede rápidamente revelar resultados inesperados como, en este caso, el principal sustrato YfeA siendo cinc y no los sustratos fisiológicos documentado hierro o manganeso16. Si se utiliza antes de recopilar datos de dispersión de rayos x, fluorescencia de rayos x puede informar al investigador en diseño experimental, como la que bordea energía metal para utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo. Igualmente útil como determinar la abundancia relativa de un metal, fluorescencia de rayos x también puede determinar si un metal está ausente en una muestra, proporcionando un método rápido de separar cristales de metal que contiene apo proteína de proteína de holo y la estimación de fuerza de señal sin necesidad de mucho tiempo de procesamiento de datos. A identificar una muestra con una señal fuerte de metal, se puede determinar la longitud de onda exacta a utilizar para la recolección de datos de dispersión de rayos x anómalo por la exploración de múltiples longitudes de onda de dispersión anómala (MAD).
Este protocolo detallado está destinada a nuevos experimentadores con éxito realizar fraccionamiento celular y hacer uso eficaz de hardware de línea de sincrotrón en el perfil del contenido metálico total y el estudio de proteínas de unión a metal.
Fraccionamiento celular es una herramienta útil para sondear específicamente el contenido de un compartimento celular y puede servir como una herramienta útil para la extracción de pequeñas moléculas como los átomos del metal, así como macromoléculas como las proteínas. Cabe destacar que fraccionamiento celular no es una técnica absoluta y puede ser propenso sin cuidado de mezcla/resuspensión, temperatura de incubación y tiempo de incubación. Mezcla incompleta puede ocasionar lisis membranosa mínimo y así insignificante fraccionamiento, fraccionamiento a temperatura ambiente puede causar lisis rápida de ambas membranas dando por resultado la contaminación de la fracción de periplasmic con contenido citoplasmático, y tiempos de incubación prolongado también pueden resultar en excesiva lisis y por lo tanto la contaminación de la fracción. Un compromiso razonable para lograr la lisis de la membrana externa eficiente y relativamente completo (conservando la membrana interna) es la incubación de 20 minutos sobre hielo en el tampón hipotónico fraccionamiento. Otra consideración es el método de extracción, donde áspera extracción por agitación o vórtex podría poner en peligro la calidad del extracto como causando la agregación de la proteína. Se recomienda mezclar suavemente como espátula, inversión o aspirando con la pipeta para mantener material de alta calidad para el análisis de aguas abajo. Purificación del fraccionamiento preparativo de la célula puede ocurrir con eficacia variable según lo evidenciado por figura 1. En un experimento, YfeA comenzó como el 8% del contenido extraído de periplasmic (figura 1), mientras que en otro experimento, YfeA comenzó como 17% del contenido periplasmic (figura 1). Estas diferencias pueden surgir de varias razones tales como las condiciones de expresión variable (adición de EDTA a los medios de crecimiento puede aumentar la expresión de genes regulados por mecanismos de inanición tales como la regulación de la piel del promotor Yfe), uso repetido de congelados acciones permanentes y error humano. En lugar de ajustar los tiempos de incubación, se recomienda intensificar la preparación. Purificación de la fracción del periplasma se recomienda incluir una elución gradiente lineal del paso cromatográfico intercambio del anión. Una elución gradiente de paso es una estrategia de elución los usos discretos y abruptos cambios en la composición de la fase móvil (es decir., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etcetera.). Una elución gradiente lineal es una estrategia de elución que utiliza un cambio gradual en el móvil fase composición (es decir, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etcetera). Un gradiente de paso es útil para separar moléculas que tienen afinidades diferentes por la fase estacionaria y una elución gradiente lineal es útil para separar moléculas que tienen afinidades similares para la fase estacionaria. En el caso de purificación de proteína con ninguna etiqueta de purificación artificial (para mejorar la afinidad por la fase estacionaria) de un compartimiento celular que es rica en especies de proteína única, se recomienda una elución gradiente lineal para separar proteínas de donaciones que pueden tienen afinidades similares a la fase estacionaria como la proteína de interés. Generalmente, se espera un rendimiento de 1-2 mg de apo purificada YfeA de cada litro de la cultura expresando YfeA de su endógeno promotor de Y. pestis .
Fluorescencia de rayos x es una técnica que permite al investigador determinar el contenido de metal en una muestra, y rápidamente informar al investigador sobre inesperada incorporación metal que sería desconocido. Aunque EDTA está incluido en el búfer de fraccionamiento hipertónica para quitar el metal libre o libremente asociados, YfeA derivado de la fracción del periplasma puede contener algunas proteínas del holo. Dado que el transporte de metales es un proceso dinámico, tal vez el contenido de proteína de holo origina YfeA que todavía no ha donado su carga a YfeBCDE. Cabe destacar que fluorescencia de rayos x sólo mide el contenido total de metal y no indica si metal es ordenado en un enrejado cristalino, o específicamente unido a una proteína. Para determinar si el metal es ordenó en un enrejado cristalino o destinado específicamente a una molécula de proteína, procesamiento y recopilación de datos de dispersión de rayos x se requiere. Sin embargo, fluorescencia de rayos x permite la evaluación rápida de la muestra de contaminación de metal y/o integración de proteína residual del holo. Tiempo de Radiación Sincrotrón es limitado y no siempre hay tiempo para diseñar una estrategia de recogida de datos de dispersión de rayos x sobre todas las muestras, así la fluorescencia de la radiografía es una técnica valiosa para la investigación de muchos cristales y prioridades para que las muestras de rayos x deben recogerse datos de dispersión. Además, fluorescencia de rayos x permite la recolección de las muestras que no pueden difractar radiografías. Mientras recolectaba datos de fluorescencia de rayos x, a veces la señal puede ser muy débil y los espectros resultantes uninformative. Para mejorar la fuerza de la señal de fluorescencia de rayos x o análisis de MAD, considere aumentar el tiempo de exposición o disminución de la atenuación del haz de rayos x. Cuando se identifica una muestra para la recolección de datos de dispersión de rayos x, se recomienda recoger datos de dispersión de rayos x en una parte diferente de la muestra que lo que se utilizaba para fluorescencia de rayos x y análisis para minimizar el daño de la radiación, mejorar la calidad de los datos de MAD colección y reducir al mínimo cualquier posibilidad para la reducción de la señal anómala.
Detección de trazadores radiactivos requiere nanomolar cantidades de material o menos, y el uso de estos marcadores como agentes de rastreo molecular proporciona un método simple y altamente sensible de sondar los procesos celulares. El ensayo de radiometal mencionado anteriormente puede ser usado para determinar absorción de metal total, distribución en compartimentos celulares, así como las tasas de absorción. De hecho, cada momento de datos requiere un fraccionamiento de 40 minutos; sin embargo, como se alcanza cada punto del tiempo, las células son inmediatamente peleteadas e incubadas en tampón salino alto (figura 5paso 1). RadioMetal mediciones de los medios, desechado tampón salino alto (figura 5paso 1) y fracciones citoplasmáticas y periplasmic después (figura 5paso 3) indican que la incubación de tampón salino alto elimina con éxito los metal libre restante de lances que quedaron después de la centrifugación inicial después de alcanzar el punto del tiempo. La centrifugación inicial elimina la mayoría (hasta un 80%) del metal free lances y la centrifugación después de incubación en el buffer sal alta también elimina metal free lances restantes adicional. No se espera que cualquier metal libre lances persistente significativamente influencia metal transporte durante el fraccionamiento de 40 minutos. La influencia del fraccionamiento de 40 minutos en transporte intracelular del metal es otra consideración para la interpretación de datos prudentes. Prácticamente el protocolo de fraccionamiento todo ocurre sobre hielo, aparte de la centrifugación 30 segundo entre pasos. Tiempo de transporte experimentos de curso han indicado que mantienen las células a 4 ° C abroga transporte metal20,21,22; de metal por lo tanto, porque los experimentos se produce sobre el hielo, el fraccionamiento de 40 minutos no se espera que aumente significativamente los niveles de metal en el periplasma de citoplasma y se espera que los niveles de metal ser representante de los puntos de tiempo en el que las células eran inicialmente centrifugalized.
Determinación de la absorción relativa en diferentes compartimentos celulares puede ayudar a informar datos XFS, corroborar la naturaleza fisiológica de un substrato como habilitar al investigador a investigar aún más los detalles moleculares de un mecanismo. Por ejemplo, además de genética mutagénesis a experimentos de absorción de radiometal proporciona un método directo para reforzar residuos funcionales claves o moléculas involucradas en transporte de substrato. Ventajas de análisis y experimentos de absorción de radiometal incluyen respuesta rápida, alto rendimiento, alta reproducibilidad y paralelización de experimentos comparando las condiciones de crecimiento y construcciones genéticas.
The authors have nothing to disclose.
También se recogieron datos en GM/CA@APS, que ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional del cáncer (ACB-12002) y el Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General (AGM-12006). Esta investigación utilizó los recursos de la fuente avanzada del fotón (APS), un departamento de energía de Estados Unidos (DOE) de ciencia usuario oficina funcionó para la oficina DOE de ciencia por el Laboratorio Nacional Argonne bajo contrato no. DE-AC02-06CH11357. Uso de la fuente avanzada de fotones fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, bajo contrato no. W-31-109-Eng-38.
Nos gustaría reconocer la UAB Comprehensive Cancer Center – masa espectrometría/proteómica comparte instalaciones (P30CA13148-38) por su ayuda en el análisis de espectrometría de masas.
C.D.R. fue apoyado por una beca de la Universidad de Alabama en Birmingham oficina de diversidad, equidad e inclusión. L.L.R. fue apoyado por el Departamento de Radiología de la Universidad de Alabama en Birmingham. El Departamento de energía, oficina de ciencia, isótopo programa admite 52producción Mn y A.V.F.M. en grant DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |