Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Summary

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Abstract

Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.

Introduction

Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher¹gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen²beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt³. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes⁴. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL⁵verwendet werden können.

Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.

Protocol

(1) Kultur der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen Beschichtung von rekombinanten menschlichen E-Cadherin Fc Fusionsprotein (E-Cad-Fc) oder andere Matrizen für hPSC Kultur geeignet 6 Verdünnen Sie E-Cad-Fc mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung enthält Calcium und Magnesium (DPBS (+)) bis 15 μg/mL. Mantel 100 mm Federweg Gewebekultur Gerichte mit 5 mL der verdünnten E-Cad-Fc und Inkubation bei 37 ° c für mindestens 1 h …

Representative Results

Generation von Hepatozyten – wie Zellen: Abbildung 1 beschreibt den Zeitrahmen der Änderungen, die während der Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auftreten. Die Kultur der iPSCs auf E-Cad-Fc bietet ca. 2 mm Durchmesser-Kolonien, die den pluripotenten Marker OCT4 Ausdrücken (Abbildung 1A-B). Die Morphologie der Zellen auf eine E…

Discussion

Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame¹gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelfors…

Materials

100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes	Corning	430167
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes	Corning	430591
96-wells tissue culture plate	Corning	3595
Anti-human Albumin	Dako	A 0001
Anti-human FOXA2(6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
Anti-human HNF4 alpha	Santa Cruz	SC-6556
Anti-human Oct-3/4 antibody	Santa Cruz	SC-9081
Anti-human SOX17	R&D	AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Activin A Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC9563
B-27 Supplement, minus insulin	Invitrogen	0050129SA
B-27 Supplement, serum free	Invitrogen	17504044
BMP4 Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC9533
Cell Dissociation Reagent StemPro  Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	7572
DPBS+(calcium, magnesium)	Invitrogen	14040-133
DPBS-(no calcium, no magnesium)	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12, HEPES	Invitrogen	11330057
ELISA human APOB ELISA development kit	Mabtech	3715-1H-20
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)	Invitrogen	PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)	Lonza	CC-3198
Hepatocyte Growth Factor  (HGF)	Invitrogen	PHC0321
L-Glutamine	Invitrogen	25030081
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Invitrogen	11140076
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein	Invitrogen	PHC5015
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140163
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1	STEMCELL technologies	5850
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA Substrate Solution	Thermo Scientific	34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%	Lonza	17-711E
Y-27632 ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302