여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.
Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.
희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인1되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포2를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접3. 환자 전용 Ipsc의 사용 하면서 희귀 한 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 발견 하는 도구는 개념적으로 합리적으로이 접근4의 타당성을 입증 하는 몇 가지 보고서만 있다. 그러나, 우리는 최근 iPSC 파생 hepatocytes 약물 간 신진 대사5결함의 치료를 위해 repurposed 수 성공적으로 확인을 사용 하는 플랫폼을 설립.
이 프로토콜 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시에 인간의 Ipsc를 차별화 하 고 작은 분자의 라이브러리 화면에 그들을 사용 하 여 과정을 설명 합니다. 그것은 또한 신진 대사 간 질환의 예로 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 끝점 분석을 설명 합니다. 이 방법은 역할 및 전염 성 간 질환, 간 대사 질환, 약물 독성, 및 다른 간 질환의 맥락에서 작은 분자의 응용 연구에 유용 해야 한다.
기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능1되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회 (DK55743, DK087377, DK102716 및 HG006398에 S.A.D)에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 Behshad Pournasr, 닥터 제임스 해 슬 롭 그들의 공헌에 대 한 란 Jing를 감사 하 고 싶습니다.
100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |