Summary
Det här protokollet beskriver kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC); en tänkbar metod som kan användas för att visualisera inducerad närheten av initieraren kaspaserna, vilket är det första steget i deras aktivering.
Abstract
Kaspas familjen av proteaser spelar viktiga roller i apoptos och medfödd immunitet. Bland dessa, en undergrupp som kallas initieraren kaspaserna är de första att aktiveras i dessa vägar. Denna grupp omfattar kaspas-2, -8, -9, samt inflammatoriska kaspaserna, kaspas-1, -4 och -5. Initieraren kaspaserna är alla aktiveras av dimerization efter rekryteringen till specifika multiprotein komplex som kallas aktivering plattformar. Kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) är ett imaging synsätt där delade fluorescerande proteiner smält till initieraren kaspaserna används för att visualisera rekrytering av initieraren kaspaserna deras aktivering-plattformar och den resulterande inducerad närhet. Denna fluorescens ger en avläsning av en av de tidigaste steg som krävs för initieraren kaspas aktivering. Använder ett antal olika mikroskopi-baserat tillvägagångssätt, kan denna teknik ge kvantitativa uppgifter om effektiviteten av kaspas aktivering på befolkningsnivå samt kinetiken för kaspas aktivering och storlek och antal kaspas aktivera komplex på basis per cell.
Introduction
Familjen kaspas proteas är kända för sina kritiska roller i apoptos och medfödd immunitet 1. På grund av sin betydelse, bestämma när, var och hur effektivt specifika kaspaserna aktiveras kan ge viktiga insikter i mekanismerna för kaspas aktiveringen vägar. Imaging baserade protokollet beskrivs här möjliggör visualisering av tidigaste stegen i kaspas aktiveringen kaskad. Denna teknik tar fördel av de dynamiska protein: protein interaktionerna att driva kaspas aktivering.
Kaspaserna kan delas in i två grupper: initiativtagare kaspaserna (kaspas-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 och -12) och bödeln kaspaserna (kaspas-3, -6 och -7). Bödeln kaspaserna är närvarande i cellen som förformade dimerer och aktiveras genom klyvning mellan stora och små subuniten 2. När aktiverad, klyva de många strukturella och reglerande proteiner som leder till apoptos 3. Initieraren kaspaserna är första kaspaserna att aktiveras i en väg och allmänt utlösa aktivering av bödeln kaspaserna. I motsats till bödeln kaspaserna aktiveras initiativtagare kaspaserna av dimerization 4,5. Denna dimerization underlättas genom rekrytering av inaktiva monomerer till specifika stor molekylvikt komplex kallas aktivering plattformar. Montering av aktiveringen plattformar styrs av en rad specifika protein: protein interaktioner. Dessa förmedlas av bevarat protein interaktion motiv i den proform av de initierare kaspas och inkluderar döden domän (DD), döden effektor domän (DED) och kaspas rekrytering domän (kort) 6 (figur 1A). Aktivering plattformar omfattar i allmänhet en receptorprotein och en adapter protein. Receptorn aktiveras vanligtvis vid bindning av en ligand, förmå en conformationaländring som möjliggör oligomerisering av många molekyler. Receptorn sedan rekryterar antingen den kaspas direkt eller adapter molekyler som i sin tur leda till kaspas till komplex. Således komma många kaspas molekyler i närheten som tillåter dimerization. Detta är känt som den inducerade närhet modell 7. När dimerized, genomgår kaspas autoprocessing, som tjänar till att stabilisera den aktiva enzym 4,8. Exempelvis utlöses montering av den Apaf1 apoptosome av cytokrom c efter dess frigörare från mitokondrierna i en process som kallas mitokondriell yttre membran permeabilisering (MOMP). Apaf1 rekryterar i sin tur kaspas-9 genom en interaktion som medieras av ett kort som är närvarande i båda proteiner 9. Liknande proteininteraktioner resultera i montering av CD95 döden inducerande signalering komplexa (skiva) som leder till kaspas-8 aktivering; den PIDDosome, som kan aktivera kaspas-2; och olika inflammasome komplex som initiera kaspas-1 aktivering 10,11,12. Således, initiativtagare kaspaserna rekryteras till specifik aktivering plattformar av en gemensam mekanism som resulterar i inducerade närhet och dimerization, utan vilken aktiveringen inte kommer att inträffa.
Kaspas Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) är en imaging-baserade analysmetod som utvecklats för att mäta detta första steg i aktiveringen av initieraren kaspaserna, så att direkt visualisering av kaspas inducerad närhet efter aktiveringen plattform montering. Denna metod utnyttjar egenskaperna av split fluorescerande protein Venus. Venus är en ljusare och mer fotostabilt version av gula fluorescerande protein (YFP) som kan delas in i två icke-fluorescerande och något överlappande fragment: N-terminalen av Venus (Venus N eller VN) och C-terminus Venus (Venus C eller VC). Dessa fragment kvar möjligheten att refold och blir fluorescerande när i närheten av 13. Varje Venus fragment smälts på den prodomain av den kaspas, som är den minimal del av den kaspas som binder till aktiveringen plattformen. Detta säkerställer att kaspaserna behåller inte enzymatisk aktivitet och därför samtidig analys av efterföljande händelser associerade med endogena händelser är möjligt. Venus fragment refold när kaspas prodomains rekryteras till aktiveringen plattformen och genomgå inducerad närhet. (Figur 1B). Den resulterande Venus fluorescensen kan användas för att noggrant och särskilt övervaka subcellulär lokalisering, kinetik och effektiviteten i montering av initieraren kaspas aktiveringen plattformar i enstaka celler. Imaging data kan förvärvas genom konfokalmikroskopi eller standard fluorescensmikroskopi och kan anpassas till ett antal olika mikroskopi metoder inklusive: time-lapse imaging för att spåra kaspas aktivering i realtid; hög upplösning imaging för exakta bestämningar av subcellulär lokalisering; och slutpunkten kvantifiering av aktiveringen effektivitet.
Denna teknik utvecklades först för att undersöka aktivering av kaspas-214. Medan den aktivering plattformen för kaspas-2 tros vara PIDDosome, som består av receptorn PIDD (p53-inducerade protein med en död domän) och adapter RAIDD (RIP-associerade ICH-1/CAD-3 homologa protein med en död domän), PIDDosome-oberoende kaspas-2 aktivering har rapporterats. Detta tyder på att ytterligare aktivering plattformar för kaspas-2 finns 15,16. Trots att inte veta full komponenterna av kaspas-2 aktivering plattformen, har kaspas BiFC teknik möjliggjort framgångsrika förhör av signalvägar som kaspas-2 på molekylär nivå 14,17. Vi har också framgångsrikt anpassat detta protokoll för inflammatoriska kaspaserna (kaspas-1, -4, -5 och -12) 18 och, i princip samma tillvägagångssätt bör räcka till på samma sätt analysera varje återstående initieraren kaspaserna. Detta protokoll skulle likaså kunna anpassas att undersöka andra vägar var dimerization är en viktig aktiverande signal. Exempelvis aktiveras STAT proteiner av dimerization efter fosforylering av Janus kinase (JAK) 19. BiFC systemet kan således användas för att visualisera för STAT aktivering samt många andra vägar som regleras av dynamiska proteininteraktioner. Följande protokoll ger stegvisa instruktioner för införandet av reportrar i celler samt metoder för bild förvärv och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler och kultur rätter
Obs: Utför steg 1-3 i en vävnadskultur LAF. Använd handskar.
- Om du använder glas botten rätter, coat glaset med Fibronektin. Hoppa till steg 1.2 om använder plast rätter.
- Göra en 0,1 mg/mL lösning av Fibronektin: Späd 1 mL av 1 mg/mL Fibronektin lösning i 9 mL 1 X PBS.
- Täcka glas botten av varje brunn med 0,5-1 mL av Fibronektin och inkubera i 1-5 min i rumstemperatur.
- Med en pipett, samla Fibronektin lösningen och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Fibronektin lösningen kan återanvändas flera gånger. - Tvätta glaset en gång med 1-2 mL 1 X PBS och aspirera av PBS.
- Tallrik 1 x 105 celler per brunn 6-well platta i 2 mL cell lämplig kultur media (se tabell 1 för cell nummer att använda för olika stora brunnar). Om du använder en cellinje som stabilt uttrycker kaspas BiFC komponenterna (se diskussion), tallrik 2 x 105 celler och vidare till behandling steg (steg 3).
- Tillåta celler att följa skålen över natten vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator.
2. transfection celler att införa kaspas BiFC komponenter
- Transfect celler med lämpliga transfection reagens.
Obs: Detta protokoll beskrivs instruktionerna för Lipofectamine 2000, som har optimerats för minimal toxicitet. Detta protokoll har använts framgångsrikt i Hela celler, MCF7 och LN18 celler. Om du använder ytterligare transfection reagenser följa tillverkarens anvisningar och optimera som behövs.- Tillsätt 12 µL av transfection reagens till 750 µL av minskade serum media i ett sterilt rör.
- Odla i rumstemperatur i 5 min.
- Lägg till 10 ng av en reporter plasmid (en plasmid kodning en fluorescerande protein, t ex röd fluorescerande protein [RFP], som kommer att märka de transfekterade cellerna) till en steril 1,5 mL tub för varje brunn för att vara transfekterade.
- Lägg till 20 ng av varje kaspas BiFC plasmid (t.ex., 20 ng för kaspas-2 prodomain [C2 Pro]-VC och 20 ng av C2 Pro-VN) till varje rör (tabell 2).
- Ta varje rör upp till en total volym av 100 µL genom att lägga till minskade serum media.
- Med p200 pipett, tillsätt 100 µL av transfection reagenslösningen från steg 2.1.2 till plasmid blandningen i ett droppvis sätt.
- Inkubera plasmid-transfection reagens mixen i 20 min i rumstemperatur.
- Sug ut media från cellerna med pipett eller med sug och sedan, med p1000 pipett Pipettera 800 µL serum fria medier försiktigt ner sidan av brunnen.
- Med p200 pipett tillsätt 200 µL av komplexet DNA-lipid droppvis till varje brunn.
- Inkubera cellerna i en vävnad kultur inkubator vid 37 ° C för 3 h.
- Noga med att inte störa enskiktslager, ta bort serum fria medier som innehåller DNA-lipid komplexen av aspiration med sug eller med en pipett.
- Överför med pipett 2 mL av pre värmde (37 ° C) komplett tillväxtmassmedia försiktigt ner på sidan av varje brunn.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en vävnadskultur inkubator för 24-48 h för optimal proteinuttryck.
3. induktion av kaspas aktivering
- Behandla med ett läkemedel eller stimulus som inducerar kaspas aktiveringen ungefär 24 h efter transfection.
- Lägg till önskad koncentration av läkemedlet till pre värmde (37 ° C) imaging media (komplett tillväxtmassmedia kompletteras med Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] och 2-merkaptoetanol [55 µM]) och blanda försiktigt (tabell 3).
- Sug ut media från cellerna med pipett eller med sug och sedan, med pipett överför med pipett 2 mL av lösningen från 3.1.1 försiktigt ner sidan av brunnen.
- Lägg till imaging media utan drogen till en brunn som en obehandlad kontrollodling.
- Inkubera cellerna i en vävnad kultur inkubator vid 37 ° C eller Fortsätt till steg 4.3 för en time-lapse experiment.
4. Caspase BiFC datainsamling
-
Caspase BiFC för enkel tid punkt förvärv
- Slå på mikroskopet och fluorescerande ljuskälla efter tillverkarens anvisningar.
- Hitta celler under RFP filter och fokus på reporter gen fluorescensen.
- Använda en hand-tally counter, räkna alla RFP-positiva celler i synfältet. Anteckna hur många.
- Bibehållen samma synfält, växla till GFP filter (eller YFP filter om tillgängligt) och, med hjälp av en hand-tally counter, räkna antalet erytrocyter som också är gröna (Venus-positiv). Växla fram och tillbaka mellan de två filtren att säkerställa att endast de röda blodkropparna utvärderas för Venus-positivitet. Registrera antalet (figur 3).
- Räkna minst 100 RFP-positiva celler från alla tre enskilda områden av plattan.
- I varje område, beräkna procentandelen av Venus-positiv transfekterade celler (dvs. erytrocyter som också är gröna). Genomsnitt de resulterande procentsatserna för att få standardavvikelsen.
-
Tredimensionell avbildning av kaspas BiFC
- Slå på mikroskopet efter tillverkarens anvisningar och starta programvaran förvärvet.
- Välj de 60 x eller 63 x olja mål och placera en droppe olja på målet
- Placera skålen kultur på Mikroskop scenen med innehavaren rätt tallrik.
- Använd antingen en epifluorescence ljuskälla och Mikroskop ögat bit eller confocal lasrar och datorskärmen, navigera till ett fält av intresse.
- Fokusera på reporter fluorescensen med RFP laser eller filter.
- Om epifluorescence har använts fram till denna punkt, byta ljuskälla till de confocal lasrarna och visualisera live-avbilden av cellerna som förvärvade av kameran och visas av programvaran förvärvet på datorskärmen.
- Använda joystick kontroll och fokus ratten, finjustera fokus och position av cellerna så att cellerna är i mitten av sökaren. Välj celler som är separerade från varandra och inte överlappar.
- Ineffekt den procentandel laser till 50% och exponering på 100 ms för både Venus och RFP som utgångspunkt att avgöra de optimala inställningarna för experimentet.
- Slå på det levande ta till fångst och inspektera den resulterande bilden och medföljande display histogrammen för båda kanalerna.
- Om signalen är låg och bilden är svårt att urskilja, öka procentsats laser power och/eller exponering tid i steg tills signalen i bilden ser bra ut.
- Se till att signalen inte når mättnad. Inspektera display histogrammet för att kontrollera en distinkt topp är synliga för varje fluor. Om toppen omfattar hela histogramfönstret, inmatningsinställningar lägre laser effekt och exponering (figur 2).
- Visualisera kontroll (obehandlade eller icke-transfekterade) celler på samma villkor för att signalen ska vara specifik.
Obs: Enfärgad transfectants kan också användas till kontroll för crossover, men om signalerna är rumsligt skilda (e.g. mitokondriell kontra cytosoliska) Detta är inte nödvändigt. - Välj eller öppna modulen Z stack i Mikroskop mjukvaran.
- Använda fokus ratten, ungefärliga fokal positionen motsvarar mitten av cellen.
- Justera fokus i en riktning tills cellen är inte längre synlig, Välj detta toppositionen.
- Justera fokus i motsatt riktning tills cellen är igen inte längre synliga och välj detta som bottenläget.
- Välj den optimala steg storleken (vanligtvis cirka 20 µm) och börja att förvärvet instruera kameran för att automatiskt ta en enda bild i varje kanal på varje 20 µm steg mellan topp och botten ståndpunkter.
- Använda 3D-program för att rekonstruera 3D-bilden (figur 4film 1).
-
Time-lapse avbildning av kaspas BiFC
- Minst 1 tim före experimentet, slå på mikroskopet och Ställ in temperaturen till 37 ° C.
- Välj 40 x eller 60 x 63 x olja mål och placera en droppe olja på målet.
- Placera skålen kultur på Mikroskop scenen med innehavaren rätt tallrik.
- Om en CO2 källa är tillgänglig, placera på CO2 leverans-enheten (vanligtvis en plexiglas bifogade locket till röret som levererar den CO2) ovanpå plattan innehavaren. Ställ in CO2 -nivå på 5% och slå på CO2 handkontroll från inom programvaran. Om en CO2 källa inte är tillgänglig, inkludera 20 mM Hepes att buffra media.
- Navigera till ett fält av transfekterade celler och visualisera live-avbilden av cellerna som förvärvade av kameran och visas av programvaran förvärvet på datorskärmen använder RFP lasern.
- Efter steg 4.2.8-4.2.12, ingång inställningarna för procentandel laser effekt och exponering tid för RFP lasern. Hålla dessa värden så låga som möjligt samtidigt som du kan upptäcka fluorescerande signalen.
- Med en positiv kontroll prov (se tabell 3 för exempel), Följ steg 4.2.8-4.2.12 att mata in inställningarna för procentandel laser effekt och exponering tid för YFP laserljuset. Hålla dessa värden så låga som möjligt samtidigt som du kan upptäcka Venus signal.
- För varje brunn av plattan, välja ett antal olika positioner som innehåller en eller flera celler som uttrycker reportern.
- Mata in tidsintervallet mellan varje bildruta av time-lapse och totala antalet bildrutor som ska tas. Se till att det finns tid att förvärva alla markerade positioner innan nästa bildruta ska tas.
- Re-Visit varje position och korrigera och uppdatera fokus som behövs.
- För att korrigera för focal drift som kan orsakas av förändringar i temperatur eller externa vibrationer, slå på fokus drift korrigering systemet (om tillgängligt).
- Påbörja den time-lapse och spara data.
- Analysera data med hjälp av tillgängliga bildprogram (figur 5film 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel av kaspas-2 BiFC induceras av DNA-skador visas i figur 3. Camptothecin, en topoisomeras jag hämmare, användes för att inducera DNA skador och kaspas-2 aktivering. Den röda fluorescerande protein mCherry användes som en reporter att visa att cellerna express BiFC sonden och för att visualisera det totala antalet celler. Venus fluorescens visas i grönt och den stora puncta representerar kaspas-2 inducerad närhet. Dessa celler kan räknas för att bestämma procentandelen av Venus-positiva celler. Slutsatser om subcellulär lokalisering kan också göras från sådana bilder. I exemplet som visas upptäcktes kaspas-2 inducerad närhet i nucleolus såväl som i cytoplasman 17. För att ge hög upplösning visualisering av subcellulär lokalisering av kaspas aktiveringen komplexa, kan enstaka celler avbildas i tre dimensioner. Figur 4 visar två sätt att representera sådana 3D bilder. Först är att generera en 3D rekonstruktion av cellen. Exemplet visar camptothecin-inducerad kaspas-2 BiFC i grönt och kärnan i rött. Den 3D rekonstruktionen visar relativa localizationen av båda fluorophores hela cellerna. Denna typ av resultatvisning är speciellt effektiva när presenteras som en film, roterande cellen runt en enda axel (film 1). Den andra panelen är vyn ortogonala i samma cell. Detta ger xy, xzoch yz visualisering av cellen vid en viss punkt i cellen. Skildring av resultat på detta sätt kan vara mer lämpad för en papper presentation som i en tidskriftsartikel eftersom det är lättare att tolka 3D data presenteras i en 2D format. Figur 5 visar ett exempel på time-lapse avbildning av kaspas-2 BiFC i en glioblastoma cell fodrar behandlas med den proteasom-hämmare bortezomib (se även Movie 2). Grafen visar ökning i genomsnittlig Venus intensiteten per cell i genomsnitt över ett antal celler (anpassad från 20). Denna typ av data kan också visas som ett antal enstaka cell spår på en graf. I exemplet, är uppkomsten av kaspas inducerad närhet cirka 2 timmar efter behandling.
Figur 1: Schematisk av kaspas struktur och bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) metodik. (A) allmänna struktur en initierare kaspas. Prodomain, stora och små subunitsna, och den bevarade QACRG motiv som innehåller den aktiva platsen cystein avbildas. (B) BiFC använder split fluorescerande proteiner som ensam inte är fluorescerande men kan associera för att reformera den fluorescerande molekylen när smält till samverkande proteiner. För kaspas BiFC, prodomain (Pro) eller fullängds kaspas smälts på den N-terminalen hälften (Venus-N) och C-terminalen hälften (Venus-C) av Venus. I deras monomer tillstånd är kaspas fusionsproteinerna inte fluorescerande. Vid rekrytering till en aktivering plattform, såsom PIDDosome, som visas här, upprätthålls sammanslutning av de två halvorna av Venus som representerar kaspas inducerad närhet som mäts som en ökning i Venus fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ bild för att erkänna mättnad med hjälp av displayen histogrammet. Exempel på optimala (övre panelen) och mättade signaler (nedre panelen) visas. De Venus (gul topp) och RFP (röd topp) signaler visas. X-axeln anger intensiteten och y-axeln är antalet pixlar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kaspas-2 bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) efter DNA skador. Hela-celler som uttrycker kaspas-2 BiFC komponenterna var vänster obehandlade (A) eller behandlats med camptothecin (100 µM) (B) i närvaro av qVD-OPH (20 µM). mCherry var samtidig uttryckt som fluorescerande reporter. Representativa bilder visar celler (röd) med kaspas-2 BiFC (grön) i camptothecin-behandlade celler 16 h efter behandling. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: lokalisering av kaspas-2 bimolecular fluorescens komplettering (BiFC). Hela celler uttrycker kaspas-2 BiFC komponenterna och fluorescerande nukleära reporter behandlades med camptothecin (20 µM) i närvaro av qVD-OPH (20 µM). 3D rekonstruktioner består från 0,1 μm seriell confocal bilder via z-planet av cellen har gjorts efter 24 h och visar kärnan i röda och kaspas-2 BiFC i grönt. Den vänstra panelen visar en 3D maximalstyrkan projektion rendering rekonstruktion (se också film 1). Den högra panelen visar vyn ortogonala skivor i samma cell. Den mellersta rutan (blå) är xy -planet, den högra rutan (gul) är yz planet och digitalbox (vit) är på xz -planet. Yz och xz plan skär enligt hårkorset. Skala staplarna representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Time-lapse av kaspas bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) (A) LN18 glioblastoma celler transfekterade med kaspas-2 BiFC komponenter och en röd fluorescerande mitokondriell markör (DsRed-mito, röda) som behandlats med bortezomib (15 nM) i närvaro av qVD-OPH (20 µM). Cellerna var placerade på en confocal Mikroskop vid 37 ° C och bilder togs varje 2 min för 8 h. bilder av representativa celler från den time-lapse visar att inducerade närheten av de två kaspas-2 BiFC komponenterna resulterade i en ökning i Venus fluorescens ( gröna) över tid. (B) den genomsnittliga intensiteten av Venus i varje cell vid varje tidpunkt mättes. Venus fluorescens ökade med tiden efter bortezomib behandling. Division i den obehandlade kontrollen anges från laserljus (figur anpassad från 20) villkor på låg eller försumbar toxicitet. Skala barer representera 20 µm. felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av 8 (kontroll) och 14 (bortezomib) enskilda celler (se även Movie 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Storleken på plattan | Antal celler | Volymen av media |
| 6 väl plattan | 1 x 105 celler / väl | 2 mL |
| 12 väl plattan | 5 x 104 celler / väl | 1 mL |
| 24 väl plattan | 2,5 x 104 celler / väl | 0,5 mL |
| 4 kammare maträtt | 2,5 x 104 celler / kammare | 1 mL |
| 8 kammare maträtt | 1,25 x 104 celler / kammare | 0,5 mL |
Tabell 1: riktlinjer för antalet celler att plattan. Om du använder celler som stabilt uttrycker kaspas bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) komponenter, dubbla plattan de belopp som visas här.
| Storleken på plattan | Transfection reagens | Minskad serum media | Reporter plasmid | Kaspas-pro VC plasmid | Kaspas-pro VN plasmid | Minskad serum media lagt till plasmid mix | Transfection reagenslösningen lagt till plasmid mix | Serum fria medier tillsätts celler |
| 6 väl plattan | 12 µL/platta | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | till totalt 100 µL | 100 ΜL | 800 ΜL |
| 12 väl plattan | 12 µL/platta | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | till totalt 50 µL | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24 väl plattan | 12 µL/platta | 750 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | till totalt 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 4 kammare maträtt | 4 µL/platta | 250 ΜL | 2,5 ng | 5 ng | 5 ng | till totalt 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 8 kammare maträtt | 4 µL/platta | 250 ΜL | 1.25 ng | 2,5 ng | 2,5 ng | till totalt 12,5 µL | 12.5 ΜL | 100 ΜL |
Tabell 2: rekommenderade mängder reagens som används för övergående transfection. Obs: mängden plasmid föreslog är bara en utgångspunkt. Om ingen signal detekteras, rekommenderas att titrera plasmiden från 20-200 ng per brunn 6-bra platta.
| Kaspas | Behandling | Koncentration | Tid | Förväntade resultat |
| Kaspas-1 | Över uttryckt ASC | 250 ng per brunn 6 väl platta | 48 h | 50% BiFC positiva |
| Kaspas-2 | Över uttryckt RAIDD | 500 ng/brunn 6 väl platta | 24 h | 90% BiFC positiva |
| Camptothecin | 100 ΜM | 16 h | 30-60% BiFC positiva | |
| Värme chock | 1 h vid 45 ° C | 16 h | 80% BiFC positiva | |
| Kaspas-4 | Överuttryckt NALP1 | 250 ng per brunn 6 väl platta | 48 h | 30% BiFC positiva |
| Kaspas-5 | Överuttryckt IPAF | 250 ng per brunn 6 väl platta | 48 h | 15% BiFC positiva |
Tabell 3: exempel på positiva kontroller för kaspas bimolecular fluorescens komplettering (BiFC). Villkor och förväntade resultat är baserade på publicerade data använder Pro konstruerar 14,17,18. Tillsammans uttryckt plasmider bör vara transfekterade tillsammans med BiFC plasmidsna (steg 2.1.4)
Film 1: 3D lokalisering av kaspas-2 bimolecular fluorescens komplettering (BiFC). 3D rekonstruktion, roteras runt y-axeln av confocal bilder via z-planet av en Hela celler uttrycker kaspas-2-BiFC komponenterna och fluorescerande nukleära reporter behandlades med camptothecin (20 µM) för 16 h. Filmen visar kaspas-2 BiFC (grön), och kärnan (röd). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: Time-lapse av kaspas-2 bimolecular fluorescens komplettering (BiFC). LN18 glioblastoma celler transfekterade med kaspas-2 BiFC komponenter och behandlats med bortezomib (15 nm) var avbildade varje 2 min för 8 h. Filmen visar kaspas-2 BiFC (grön) och mitokondrierna (röd). Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll diskuterar användningen av split fluorescerande proteiner att mäta kaspas inducerad närhet. Split Venus valdes för denna teknik eftersom det är mycket ljus, mycket fotostabilt och den vika är snabb 13. Analysen av Venus vika vid kaspas inducerad närhet kan således ge nära realtid anseende av kaspas protein interaktion dynamics. Venus är uppdelat i två något överlappande fragment, N terminalen av Venus (Venus-N eller VN) som består av aminosyror 1-173 och C terminalen fragment (Venus-C eller VC) bestående av rester 155-239. Finns det andra split fluorescerande proteiner men vissa, såsom split mCherry, kräver inkubation vid 4 ° C i upp till 2 h för vika 21. Ytterligare split fluorescerande proteiner inklusive split Cerulean (en version av cyan fluorescerande protein) och den långt rött split mLumin har ännu inte testas i detta sammanhang 13,22. Slutligen, om dessa fluorescerande proteiner bevisa lämplig för att mäta kaspas inducerad närhet, kan detta möjliggöra för samtidig utvärdering av flera kaspaserna.
Allmänhet, regionen prodomain (Pro) i kaspas smälts på split fluorescerande fragment. Denna region innehåller minimal portion av den kaspas krävs att binda till aktiveringen plattformen och omfattar kortet eller DED interaktion motivet. Fördelen med att använda den prodomain är att det inte införa några enzymatisk aktivitet i cellerna. Detta möjliggör samtidig övervakning av efterföljande händelser på grund av den endogena kaspas. Forskning hittills har visat liten skillnad i kinetik och lokalisering av kaspas BiFC mellan den prodomain och fulla längd kaspas 14. Fullängds konstruktioner tenderar dock att uttrycka med lägre effektivitet, vilket nödvändiggör transfection av ökade mängder av plasmid DNA. Dessutom rekommenderas att mutera den katalytiska cystein till en serine att förhindra kaspas-inducerad apoptos på uttryck. Trots dessa nackdelar, kan vissa utredningar kräva samtidig analys av full längd BiFC paren att avgöra om det finns innehållsberoende skillnader i kaspas inducerad närhet i närvaro eller frånvaro av katalytisk domäner.
Detta protokoll är speciellt anpassade för HeLa cells. Samma protokoll fungerar bra för ytterligare vidhäftande cellinjer inklusive de mammary cancer cellinje, MCF-7, glioblastoma cell fodrar, LN18 och mus embryonala fibroblaster (MEF). Det rekommenderas att användaren optimerar både plätering och transfection förhållanden när anpassa detta protokoll till en ny celltyp. Protokollet beskrivs två huvudsakliga mikroskopi strategier som kan användas för att utvärdera cellerna: epifluorescence och konfokalmikroskopi. När du använder konfokalmikroskopi, måste celler pläteras på glas coverslips eftersom majoriteten av hög numeriska bländaröppningen mål som används i samband med konfokalmikroskopi inte kommer tränga tjockleken på plast rätter eller glasskivor. Därför är det rekommenderat att använda rätter med inbäddade nr 1,5 glas coverslips som har optimal täckglas tjocklek 0.17 mm. Finns ett antal olika typer av dessa rätter som spänner från enskilda 3 cm rätter, till kammaren diabilder, till standardstorlek plattor med flera. Tabellerna 1 och 2 beskriver hur man kan anpassa plätering och transfection instruktionerna för de olika väl. För epifluorescence imaging som beskrivs här (4.1), standard plast vävnadsodling plattorna är tillräcklig så länge mikroskopet är utrustad med långa pass mål.
Eftersom denna strategi är effektivt en ”lampor på” metod för att mäta kaspas aktivering, är införandet av en fluorescerande reporter viktigt både för att tillåta visualisering av cellerna före eller i avsaknad av aktiveringen av kaspas reporter och för att identifiera de transfekterade cellerna, när övergående transfection används. Ett antal olika reportrar kan användas och de enda kriterierna när du väljer en är: 1) fluorophore är tillräckligt ljus så att det enkelt kan upptäckas genom imaging protokoll. och 2) dess fluorescerande spektrum inte överlappar med de YFP. Grönt fluorescerande protein (GFP) bör till exempel inte användas som reporter, eftersom det kommer att upptäckas av YFP filtret eller laser används för att upptäcka Venus. Detta beror på den spektrala överlappningen av de två fluorophores. Att välja en fluorophore som lokaliserar till en viss organell kan ge ytterligare kvalitativ information. Exempelvis användning av ett protein att mål mitokondrierna, såsom röd fluorescerande proteinet DsRed-mito, kan ge ytterligare information om cellen övergripande lönsamhet. Mitokondrier tenderar att genomgå fragmentering (fission) under de tidiga stadierna av cell död 23 och detta kan visualiseras med en reporter som DsRed-mito. Användningen av en organell markör som reporter kan också tillåta slutsatser om subcellulär lokalisering av kaspas BiFC göras.
Det finns ett antal sätt att kaspas BiFC data kan förvärvas och analyseras. Bestämma vilken metod du ska använda bestäms av parametrarna att utforskas (endpoint befolkningen analys kontra enskild cell positionella eller kinetiska information) och tillgången på instrumentering och bildhanteringsprogram. Detta protokoll beskriver några Mikroskop-baserade metoder för att samla in resultaten av en kaspas BiFC experiment för att förvärva både enstaka tidpunkter och time-lapse data. Men det bör noteras att ett antal variationer och kombinationer av dessa metoder som används för att kreativt förhöra kaspas aktiveringen vägar.
Enda tidpunkt datainsamling (4.1) används för att bestämma procentandelen av celler med kaspas inducerad närhet vid en enda tidpunkt. För detta protokoll räknar en helt enkelt antalet transfekterade celler som Venus-positiva. Således mycket specialutrustning krävs inte och endast de mest grundläggande epifluorescensmikroskop med GFP (eller YFP) och RFP-filter och en hand tally counter behövs. Vissa bildsystem kan automatiseras för att automatiskt ta ett antal bilder per brunn platta. Om det finns sådana instrumentation cellerna i de förvärvade bilderna kan räknas på samma sätt genom okulärbesiktning eller quantitated med programvara för bildåtergivning. Tredimensionell avbildning (4.2) ger högupplösta bilder av kaspas BiFC hela fokal hyvlar av cellen. En confocal Mikroskop med lasrar som exciterar Venus och RFP (eller den valda transfection reportern) och Z-stack kapacitet krävs. Finns ett antal 3D-rendering programmoduler som ger olika sätt att visualisera data. För båda dessa typer av analys är det möjligt att fixa bilden och cellerna eller bedöma dem vid ett senare tillfälle. Men processen för fixering minskar signalen Venus, vilken kunde lägga till artefakter i analysen och detta tillvägagångssätt rekommenderas därför inte. Time-lapse imaging (4.3) kan användas för att ge samtidig kinetiska och positionella analys av kaspas BiFC. Mikroskop utrustad med motoriserad steg kan ställas in att ta bilder av flera positioner och även jämföra olika behandlingsgrupper i samma experiment.
För time-lapse, ett antal ytterligare överväganden bör beaktas. Laserljuset kan orsaka artefakter på grund av fototoxicitet eller fotoblekning och båda behöver kontrolleras för. Båda kan i allmänhet undvikas genom att använda lägsta möjliga mängden ljus (ingång låg andel laser power och korta exponeringstider i steg 4.3.6-4.3.7). Fototoxicitet resultat när laserljuset inducerar död i cellerna och kan styras för imaging obehandlad celler på samma villkor och bekräftar att celldelningen fortsätter som vanligt. Fotoblekning uppstår när flera bilder tagna av samma cell minskar fluorescensen. Venus fluorescerande proteinet är ganska fotostabilt, så detta är sällan ett problem i praktiken. Effekterna av fotoblekning kan bestämmas genom att ta många sekventiella bilder av en Venus-positiv cell och säkerställa att fluorescensen förblir stabilt. Detta behöver bara göras en gång, så länge samma laser effekt och exponering inställningar används för varje experiment. Effekter på grund av fototoxicitet eller fotoblekning kan också minskas genom att minska det totala antalet bilder som tagits. Detta kan uppnås genom att förlänga eller förkorta tidmellanrummet mellan fångar (steg 4.3.9). Med 5-10 min mellanrum över en 16 h time-lapse är ett bra ställe att börja. Om ingen fototoxicitet observeras eller experiment av kortare varaktighet krävs, kan intervallet mellan ramar minskas. Om kaspas aktiveringen är snabb, kan kortare experiment med kortare tidsintervall användas. Till exempel för ett experiment med 16 h med 10 min mellanrum tas totalt 192 bilder (96 för varje fluorophore). En 2 h experiment med 1,5 m intervall ger 160 bilder. Därför skulle långa och korta experimenten varje utsätta celler till liknande totalbeloppen av laserljus. För kortvarig experiment kan de kaspas aktivera stimulans läggas direkt till media omedelbart före inledandet av tidsförlopp fånga (efter 4.3.11 istället för steg vid steg 3). Att göra detta, ta bort locket från plattan och försiktigt släppa en lösning innehållande den stimulans med hjälp av en pipett. Ta hand inte att knuffas plattan och snabbt kontrollera att cellerna är fortfarande i fokus innan du fortsätter.
När genomför time-lapse försök, är det också viktigt att se till att den omedelbara omgivningen av celler liknar det av en vävnadskultur inkubator. Ett antal miljökontroll är tillgängliga på olika Mikroskop set ups. Dessa inkluderar mindre scenen övre inkubatorer samt environmental chambers som inkapslar hela mikroskopet. Båda dessa enheter leverera oftast värme, CO2, och luftfuktighet till kammaren på ett sätt som kan styras exakt. Exakt kontroll av CO2 och temperaturen är viktig för framgången av experiment eftersom oväntade temperatur växlingar kan leda till focal avdrift och avsaknad av CO2 orsakar pH i media att stiga som kan vara giftigt för cellerna. Om en CO2 källa inte är tillgänglig, kan mediet buffras genom tillsats av Hepes (se steg 3.1.1). Även om en CO2 källa är tillgänglig, rekommenderas det att inkludera Hepes imaging medium som en extra åtgärd för att hålla cellerna friska. Men, även i närvaro av Hepes, avsaknad av CO2 för långa perioder kan orsaka celldöd. Det är därför viktigt att inspektera obehandlad celler, avbildas under samma förhållanden, och färgen på media vid ingående av experimentet att säkerställa att pH har varit stabil. Observera att fenolrött inte behöver utelämnas från någon av media som används i detta protokoll eftersom bidrag autofluorescens till Venus signalen är minimal.
Det finns ett antal tillgängliga metoder att analysera imaging data som härrör från en tid förflutit experiment. Mäta genomsnittlig intensiteten av Venus pixlar per transfekterade celler är det enklaste sättet att analysera tidpunkten för kaspas inducerad närhet. Som visas i figur 3, figur 4, figur 5, visas den kaspas-2 BiFC ofta som en eller flera puncta ligger i olika subcellulär fack. Imaging analys metoder för att mäta antalet foci, objektstorlek eller ytterligare liknande faktorer kan ge informativ kvantitativa data om dessa strukturer. Inte alla kaspas BiFC visas som puncta. Exempelvis visat inflammatoriska kaspaserna olika BiFC mallning inklusive diffusa fluorescens, trådlika strukturer och enstaka eller flera puncta per cell 18. Dessa mönster var beroende av den kaspas aktiveras samt uppströms aktiverande signaler. Typ av analys som är mest lämpad för time-lapse resultat kommer därför till stor del dikteras av typ av fluorescerande mönster som observeras.
Många av de behandling stimuli som bedöms när du använder det här protokollet kommer att inducera apoptos antingen direkt genom den kaspas analyseras eller indirekt genom att anlita en annan cell death väg. Detta gör att cellerna att krympa och lossna från plattan, vilket gör det mycket svårt att bild cellerna och nästan omöjligt att avgöra någon specifik lokalisering av kaspas-BiFC. Införandet av en pan-kaspas-hämmare kommer att förhindra denna celldöd. Rekrytering av kaspaserna deras aktivering-plattformar och den associerade kaspas BiFC är inte beroende av den katalytiska aktiviteten av kaspas. Därför kaspas hämning har ingen effekt på detta steg, men hämmar apoptos inklusive blebbing, lösgörande och eventuell förlust i plasmamembranet integritet nedströms fysiska egenskaper. Således, om utför endpoint analys (steg 4.1) eller Z stackar (steg 4,2), införandet av en kaspas-hämmare är viktigt. För time-lapse experiment däremot om apoptos-relaterade händelser såsom MOMP, annexin V bindande (för att upptäcka fosfatidyl serine exponering) eller propidium jodid upptag (för att upptäcka plasmamembranet vilket) kommer att analyseras tillsammans med kaspas BiFC, den kaspas-hämmare bör utelämnas för att förhindra hämning av dessa händelser. En kaspas-hämmare såsom qVD-OPh (10-20 µM) bör läggas till i media som innehåller den apoptos-inducerande stimulansen (steg 3.1.1). Om samtidig uttrycker ett pro-apoptotiska protein med kaspas BiFC komponenter, bör kaspas-hämmare läggas vid steg 2.1.12.
Kaspas BiFC är en av de få tillgängliga metoder som kan användas för att visualisera händelser i kaspas aktiveringen vägar i levande celler, måste ett antal överväganden beaktas när man utformar dessa experiment. Eftersom denna strategi är överuttryck-baserat, är kontroller för specificitet viktigt. Detta kan åstadkommas på två sätt. Det första bör införandet av enstaka punktmutationer i kortet eller DED av kaspas prodomain sådan att de störa bindningen mellan kaspas och dess aktivering plattform minska både intensiteten av kaspas BiFC och procentandelen av Venus-positiv celler. Till exempel mutation av återstoden D59 e i den prodomain för kaspas-1 stör bindning till proteinet adapter ASC (apoptos-associerade speck-liknande protein som innehåller ett kort) och lika stör ASC-inducerad kaspas-1 BiFC 18,24 . Andra, användning av celler som är bristfälliga i adapter proteiner som rekryterar till kaspas till aktiveringen-plattformen kommer att minska specifika BiFC signaler. Detta kan vara uppnådda med knockout celler, om tillgängliga eller använda siRNA eller CRISPR/Cas9-baserade metoder för att tömma celler av adaptern. Följaktligen, utarmning av proteinet kaspas-2 adapter RAIDD helt blockerad kaspas-2 BiFC induceras av värme chock eller DNA skador 14,17. För dessa experiment, den knockout eller knockdown celler bör jämföras med matchad kontroll celler (dvs kull-matchade vildtyp MEF eller kontroll knockdown celler) och, om en ny cellinje används, optimal transfection villkor bör bedömas för att säkerställa lika uttryck för BiFC reportern över cellinjer.
En andra begränsning med denna metod är att, när du använder övergående transfection, det är svårt att garantera att varje cell uttrycker lika mängder varje protein. Om uttrycket är ojämlik, kunde en Venus fragment rekryteras till plattformen vid högre frekvenser. Detta kunde maskera full fluorescerande signalen och leda till falskt negativa resultat. För att lösa detta problem, var en ny version av kaspas BiFC reporter för stabil cell linje generation nyligen rapporterade 17. Denna nya version bestod av en konstruktion som uttryckt C2 Pro-BiFC komponenterna på en enda öppen behandling ram åtskilda av viral 2A själv proteinspjälkande peptid 25. Därför är BiFC komponenterna transkriberas som en enda mRNA från samma arrangören men översatt för att producera stökiometriskt lika mängder fusionsproteinerna VC och VN. De cellinjer som genereras för att stabilt uttrycka denna konstruktion visat liknande trender av aktiveringen till normalnivå uttryckt reportrar men var både mer känsliga och visade lägre bakgrund fluorescens. Protokollet ovan kan således förenklas avsevärt om används tillsammans med reporter cellinjer som stabilt express kaspas BiFC komponenterna.
Data hittills tyder på minimal interferens mellan kaspas BiFC komponenterna och endogena proteiner. Till exempel kaspas-2 är kända för att vara aktiverade uppströms av MOMP men kaspas-2 BiFC blockerade inte utvecklingen av MOMP 14. Således verkar dessa reportrar inte agera på ett dominerande negativa sätt. Men om samtidigt utvärderar nedströms händelser, skall detta utredas inom varje uppsättning av experiment. Inklusive en kontroll som icke-transfekterade väl i experimentet är det bästa sättet att närma sig detta. Om kinetiken för celldöd är oförändrad med eller utan uttryck för kaspas sensorn, visar detta att kaspas-BiFC komponenterna inte stör endogena funktion. Däremot kunde den endogena kaspas möjligen påverka BiFC utläsningen, antingen i effektivitet eller i storlek eller form av strukturerna. Att uttrycka reportern i celler som lider brist för kaspas kommer att kontrollera för detta.
Trots dessa begränsningar är kaspas BiFC teknik en användbar metod att förhöra kaspas aktiveringen vägar som kan komplettera och även förbättra befintliga metoder för att mäta initieraren kaspas aktivering. Genom att mäta inducerad närhet, det första steget i aktivering, övervinner denna teknik problemen med mätning senare steg såsom kaspas automatisk databehandling är associerad med aktiveringen. Till exempel när du använder western blot för att övervaka klyvning av bödeln kaspaserna, ger kaspas-3 och kaspas-7, ett riktigt mått av aktiveringen 2, med samma tillvägagångssätt för initieraren kaspaserna kan vara bristfälliga. Detta beror på att klyvning av initieraren kaspaserna, inte räcker för aktivering 4,26,27. I själva verket klyvs många initiativtagare kaspaserna under apoptos av kaspas-3 utan att producera aktiva enzymer 28. Även behöva tekniker som bygger på att använda peptid substrat utformad som mål för specifika kaspaserna beakta dessa sekvenser för kaspaserna 29överlappande särdrag. Detta betyder inte att sådana metoder inte kan användas till att mäta kaspas aktivering, men nackdelarna bör erkännas när man tolkar resultaten. Caspase BiFC ger en alternativ metod som kan hjälpa till att bekräfta resultat med mer konventionella metoder. Möjligheten att spåra montering av kaspas aktiveringen komplexen i realtid och att tydligt avgöra storlek, form och lokalisering av komplexen är dessutom en betydande fördel med denna teknik som inte är möjligt att bedöma genom andra medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma alla tidigare medlemmar i Bouchier-Hayes labbet som bidragit till utvecklingen av denna teknik. Detta arbete finansierades delvis av en Texas Children's Hospital Pediatric Pilot award till LBH. Vi tackar Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) om tillstånd att inkludera data publiceras i samarbete med hennes team. Utvecklingen av de reagens som beskrivs stöddes av flödescytometri och Cell sortering Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 och NCRR S10RR024574) och hjälp av Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J.
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S.
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M.
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
