Summary
Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.
Abstract
Het caspase-familie van proteasen spelen een essentiële rol in apoptosis en aangeboren immuniteit. Daaronder een deelgroep is bekend als initiatiefnemer caspases zijn de eerste in deze trajecten moet worden geactiveerd. Deze groep omvat caspase-2, -8, -9, alsmede de inflammatoire caspases, caspase-1, -4 en -5. De initiatiefnemer caspases worden alle geactiveerd door dimerisatie na aanwerving aan specifieke multiprotein complexen genaamd activering platformen. Caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) is een imaging gebaseerde benadering waar gesplitst fluorescente proteïnen gesmolten aan initiator caspases worden gebruikt voor het visualiseren van de aanwerving van initiatiefnemer caspases aan hun activering platformen en de daaruit voortvloeiende geïnduceerde nabijheid. Deze fluorescentie biedt een uitlezing van één van de vroegste stappen die nodig zijn voor initiator caspase activering. Het gebruik van een aantal verschillende microscopie gebaseerde benaderingen, kan deze techniek kwantitatieve gegevens bieden op de efficiëntie van caspase activering op het bevolkingsniveau van een, alsook de kinetiek van de activering van caspase en de grootte en het aantal caspase activeren complexen op basis van de per cel.
Introduction
Het caspase protease familie staan bekend om hun belangrijke rol in apoptosis en aangeboren immuniteit 1. Vanwege hun belang, wanneer, waar, en bepalen hoe efficiënt specifieke caspases worden geactiveerd kan bieden cruciaal inzicht in de mechanismen van caspase activering trajecten. De visualisatie van de vroegste stappen in de opeenvolging van de activering van caspase kunnen de imaging gebaseerd protocol beschreven hier. Deze techniek maakt gebruik van de dynamische eiwit: eiwitinteractie dat station caspase-activering.
De caspases kunnen worden onderverdeeld in twee groepen: de caspases van de initiatiefnemer (caspase-1, -2, -4 -5, -8, -9, -10 en -12) en de caspases van de beul (caspase-3-6 en -7). De beul caspases zijn aanwezig in de cel als voorgevormde Dimeren en worden geactiveerd door de splitsing tussen de grote en kleine subeenheid 2. Wanneer geactiveerd, klieven zij talrijke structureel en regelgevend proteïnen wat resulteert in apoptosis 3. De initiatiefnemer caspases zijn de eerste caspases in het algemeen leiden tot de activering van de caspases van de beul te worden geactiveerd in een traject. In tegenstelling tot de beul caspases, worden initiatiefnemer caspases geactiveerd door dimerisatie 4,5. Deze dimerisatie wordt vergemakkelijkt door de aanwerving van inactieve monomeren aan specifieke grote molecuulgewicht complexen bekend als activering platformen. Vergadering van activering platformen wordt beheerst door een reeks van specifieke eiwit: eiwitinteractie. Deze zijn gemedieerd door geconserveerde eiwit interactie motieven aanwezig in de proform van de initiatiefnemer caspase en omvatten het dood domein (DD), dood effector domein (DED) en caspase werving domein (kaart) 6 (figuur 1A). Activering platformen omvatten over het algemeen een receptor eiwitten en een adapter-eiwit. De receptor is meestal geactiveerd bij de binding van een ligand, inducerende een conformationele verandering die het mogelijk voor de oligomerisatie van talloze moleculen maakt. De receptor werft vervolgens ofwel de caspase direct of adapter moleculen die op hun beurt de caspase aan het complex brengen. Zo komen talrijke caspase-moleculen in de nabijheid van dimerisatie toelaat. Dit staat bekend als de nabijheid van de geïnduceerde model 7. Zodra dimerized, ondergaat de caspase autoprocessing, die dient om de actieve enzym 4,8te stabiliseren. Vergadering van de Apaf1 apoptosome wordt bijvoorbeeld geactiveerd door cytochroom c na haar vrijlating uit de mitochondriën in een proces genaamd mitochondriale buitenmembraan permeabilization (MOMP). Apaf1 werft beurtelings caspase-9 tot en met een interactie die wordt gemedieerd door een kaart in beide eiwitten 9aanwezig. Soortgelijke eiwitinteractie resulteren in de vergadering van de CD95 dood inducerende signalering complexe (DISC) dat tot activering van caspase-8 leidt; de PIDDosome, die caspase-2 activeren kan; en verschillende inflammasome complexen dat caspase-1 activering 10,11,12te leiden. Dus, initiatiefnemer caspases worden gerekruteerd voor specifieke activering platformen door een gemeenschappelijk mechanisme wat resulteert in de nabijheid van de geïnduceerde en dimerisatie, waarzonder activering niet zal plaatsvinden.
Caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) is een imaging gebaseerde bepaling, die is ontwikkeld voor het meten van deze eerste stap in de activering van de caspases van de initiatiefnemer, waardoor directe visualisatie van caspase geïnduceerde nabijheid na activering platform vergadering. Deze methode maakt gebruik van de eigenschappen van de split fluorescent proteïne Venus. Venus is een helderder en meer photostable versie van gele fluorescerende eiwit (YFP) dat kan worden verdeeld in twee niet-belichting fluorescerende en iets overlappende fragmenten: de N-terminus van Venus (Venus N of VN) en de C-terminus van Venus (Venus C of VC). Deze fragmenten behouden de mogelijkheid om refold en fluorescerende wanneer in de directe nabijheid van 13geworden. Elk fragment Venus is gesmolten tot de prodomain van de caspase, de minimale gedeelte van de caspase dat zich aan het platform van de activering bindt. Dit zorgt ervoor dat de caspases niet enzymatische activiteit behouden en gelijktijdige analyse van downstream gebeurtenissen gekoppeld aan endogene gebeurtenissen dus mogelijk is. De Venus fragmenten refold wanneer de caspase-prodomains worden gerekruteerd voor de activering platform en ondergaan van de nabijheid van de geïnduceerde. (Figuur 1B). De resulterende fluorescentie van Venus kan worden gebruikt voor het nauwkeurig en specifiek bewaken de subcellular localisatie, de kinetiek en de efficiëntie van de vergadering van initiatiefnemer caspase activering platforms in afzonderlijke cellen. Imaging gegevens kan worden verkregen door confocale microscopie of standaard fluorescentie microscopie en kan worden aangepast aan een aantal verschillende microscopie benaderingen, met inbegrip van: time-lapse imaging als u wilt bijhouden van de activering van caspase in real-time; hoge resolutie beeldvorming voor de nauwkeurige analyse van subcellular localisatie; en eindpunt kwantificering van de efficiëntie van de activering.
Deze techniek werd eerst ontwikkeld om de activering van caspase-214onderzoeken. Terwijl het platform van de activering van caspase-2 wordt beschouwd als de PIDDosome, bestaande uit de receptor PIDD (p53-geïnduceerde proteïne met een dood domein) en de adapter RAIDD (RIP-geassocieerde ICH-1/CAD-3 homologe eiwit met een dood domein), PIDDosome-onafhankelijke caspase-2 activering heeft gemeld. Dit suggereert dat extra activeren platforms voor caspase-2 15,16bestaan. Ondanks de niet wetende de volledige onderdelen van de activering van caspase-2-platform, heeft de caspase BiFC techniek toegestaan voor succesvolle ondervraging van de signaalroutes caspase-2 op het moleculaire niveau 14,17. Wij hebben ook met succes aangepast dit protocol voor de inflammatoire caspases (caspase-1, -4 en -5 -12) 18 en, in beginsel dezelfde aanpak zou voldoende moeten zijn ook het analyseren van elk van de resterende caspases van de initiatiefnemer. Dit protocol kan ook worden aangepast om te onderzoeken van andere wegen waren dimerisatie is een belangrijk signaal voor activeren. Bijvoorbeeld, worden STAT eiwitten geactiveerd door dimerisatie na fosforylering door Janus kinase (JAK) 19. Dus, het BiFC-systeem kan worden gebruikt om te visualiseren voor STAT activering evenals vele andere trajecten dynamische eiwitinteractie geregeld. Het volgende protocol biedt stapsgewijze instructies voor de invoering van de verslaggevers in cellen en methodologieën Beeldacquisitie en analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de cellen en cultuur gerechten
Opmerking: Voer stappen 1-3 in een weefselkweek laminaire flow hood. Draag handschoenen.
- Als met glazen bodem gerechten, jas het glas met fibronectine. Ga verder met stap 1.2 als met behulp van kunststof gerechten.
- Maak een oplossing van 0,1 mg/mL van fibronectine: verdunnen 1 mL 1 mg/mL fibronectine oplossing in 9 mL 1 X PBS.
- Dekking van de glazen bodem van elk putje met 0,5-1 mL fibronectin en incubeer gedurende 1-5 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van een precisiepipet, de oplossing van fibronectine verzamelen en opslaan bij 4 ° C.
Opmerking: De fibronectine oplossing kan meerdere malen hergebruikt. - Spoel het glas een keer met 1-2 mL 1 X PBS, en gecombineerd uit PBS.
- 1 x 10 bord5 cellen per putje van de plaat van een 6-well in 2 mL van de juiste cel cultuur media (Zie tabel 1 voor cel nummers te gebruiken voor verschillende formaat putten). Als met behulp van een cellijn die stabiel de caspase BiFC onderdelen uitdrukt (zie discussie), plaat 2 x 105 cellen en overgaan tot de behandeling stap (stap 3).
- Cellen zich te houden aan de schotel 's nachts bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek toestaan.
2. de transfectie van cellen in te voeren van de caspase BiFC onderdelen
- Transfect cellen met de juiste transfectiereagens.
Opmerking: Dit protocol schetst de instructies voor de Lipofectamine 2000, die is geoptimaliseerd voor minimale toxiciteit. Dit protocol is met succes gebruikt in de Hela cellen, MCF7 cellen en LN18 cellen. Met behulp van extra transfectie reagentia volgt u de instructies van de fabrikant als optimaliseren indien nodig.- Voeg 12 µL van het transfectiereagens aan 750 µL van verminderde serum media in een steriele buis.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg 10 ng van een verslaggever plasmide (een plasmide codering een TL proteïne, b.v. rood fluorescerende eiwit [RFP], dat zal label transfected cellen) tot een steriele 1,5 mL koker voor elk putje om te zijn transfected.
- Toevoegen van 20 ng van elke caspase BiFC plasmide (b.v.20 ng van caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC en 20 ng van C2 Pro-VN) aan elke buis (tabel 2).
- Elke buis tot een totaal volume van 100 µL brengen door verminderde serum media toe te voegen.
- Met behulp van een pipet p200, voeg 100 µL van transfectie reagens oplossing uit stap 2.1.2 aan de plasmide mengsel op een dropwise manier.
- Incubeer de plasmide-transfectie reagens mix gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- De media van de cellen met behulp van een precisiepipet of afzuigen gecombineerd en vervolgens met behulp van een precisiepipet p1000 Pipetteer 800 µL van de serum mediagroep zachtjes langs de zijkant van de put.
- Met behulp van een pipet p200, 200 µL van het DNA-lipide-complex dropwise toevoegen aan elk putje.
- Incubeer de cellen in een weefselkweek incubator bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Zorg niet te verstoren de enkelgelaagde, verwijderen van de serum-mediagroep bevattende de lipide-DNA complexen aspiratie met behulp van zuiging of met een pipet.
- Pipeteer 2 mL van voorverwarmde (37 ° C) volledige groei media zachtjes langs de zijkant van elk putje.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een weefselkweek incubator voor 24-48 h voor optimale eiwit expressie.
3. activering van caspase-inductie
- Behandelen met een drug of stimulus dat caspase activering ongeveer 24 h na transfectie induceert.
- Voeg de gewenste concentratie van het geneesmiddel aan opgewarmd vooraf (37 ° C) imaging media (volledige groei media aangevuld met Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] en 2-mercaptoethanol [55 µM]) en meng voorzichtig (tabel 3).
- De media van de cellen met behulp van een precisiepipet of afzuigen gecombineerd en vervolgens met behulp van een precisiepipet, Pipeteer 2 mL van de oplossing van 3.1.1 zachtjes langs de zijkant van de put.
- Imaging media zonder de drug toevoegen aan één putje als een onbehandeld controlegewas.
- Incubeer de cellen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C of ga verder bij stap 4.3 voor een time-lapse experiment.
4. Caspase BiFC data-acquisitie
-
Caspase BiFC voor enige tijd punt verwerving
- Zet de Microscoop en fluorescerende lichtbron, na instructies van de fabrikant.
- De cellen onder de RFP filter en de focus op de verslaggever gene fluorescentie te zoeken.
- Met behulp van een hand-tally counter, tellen alle RFP-positieve cellen in het gezichtsveld. Noteer het nummer.
- Met behoud van hetzelfde gezichtsveld, overschakelen naar het GFP-filter (of YFP filter indien beschikbaar) en, met behulp van een hand-tally counter, het aantal rode bloedcellen dat ook groen zijn (Venus-positief). Heen en weer schakelen tussen de twee filters om ervoor te zorgen dat alleen de rode bloedcellen worden geëvalueerd voor Venus-positiviteit. Noteer het nummer (Figuur 3).
- Het tellen van ten minste 100 RFP-positieve cellen uit elk van de drie afzonderlijke gebieden van de plaat.
- In elk gebied, het percentage van Venus-positieve transfected cellen (d.w.z. rode bloedcellen die ook groene) te berekenen. Het gemiddelde van de resulterende percentages om de standaarddeviatie.
-
Driedimensionale beeldvorming van caspase BiFC
- Zet de Microscoop na instructies van de fabrikant en de acquisitie software starten.
- Selecteer de 60 x of 63 x olie doelstelling en breng een druppel olie op het doel
- Plaats de schotel van cultuur in het werkgebied van de microscoop met behulp van de juiste plaat houder.
- Met behulp van een epifluorescence lichtbron en de Microscoop oog stuk of de confocal lasers en het computerscherm, navigeer naar een gebied van belang.
- Focus op de verslaggever fluorescentie met behulp van de RFP laser of het filter.
- Als epifluorescence heeft tot op dit punt is gebruikt, de lichtbron naar de confocal lasers en visualiseer het live beeld van de cellen als verworven door de camera en weergegeven door de acquisitie software op het computerscherm.
- Met behulp van de joystick-controle en het wiel van de focus, fine-tunen de focus en de positie van de cellen zodat de cellen zich in het midden van de zoeker. Kies cellen die zijn gescheiden van elkaar en elkaar niet overlappen.
- Input het percentage laser vermogen 50% en de belichtingstijd bij 100 ms voor zowel Venus en RFP als uitgangspunt om te bepalen van de optimale instellingen te gebruiken voor het experiment.
- Zet de live opname en inspecteren van de resulterende afbeelding en de bijbehorende display histogrammen voor beide kanalen.
- Als het signaal laag is en de afbeelding moeilijk is uit te maken, Verhoog de percentage laser macht en/of blootstelling tijd in stappen totdat het signaal in de afbeelding ziet er goed uit.
- Zorg ervoor dat het signaal niet verzadiging bereikt. Inspecteer het histogram weergave om ervoor te zorgen dat er een duidelijke piek is zichtbaar voor elke fluor. Als de piek het gehele histogram display omvat, ingang lagere laser macht en blootstelling instellingen (Figuur 2).
- Visualiseren (onbehandelde of niet-transfected) cellen onder dezelfde voorwaarden om ervoor te zorgen dat het signaal specifiek is.
Opmerking: Enkele kleur transfectants kan ook worden gebruikt om te bepalen voor crossover, maar als de signalen ruimtelijk gescheiden (bijvoorbeeld mitochondriale versus cytosolische zijn) is dit niet nodig. - Selecteer of open de module van de stapel Z in de Microscoop software.
- Met behulp van de focus knop, bij benadering de focal positie overeenkomt met het midden van de cel.
- Pas de focus in één richting totdat de cel is niet meer zichtbaar, Selecteer deze optie als de bovenste positie.
- Pas de focus in de tegenovergestelde richting totdat de cel opnieuw niet meer zichtbaar is en selecteer deze optie als de onderste positie.
- Kies de optimale stap-grootte (meestal ongeveer 20 µm) en begin van de acquisitie om de camera te nemen automatisch één afbeelding in elk kanaal op elk van de 20 µm stappen tussen de boven- en onderkant posities.
- 3D-rendering software gebruiken voor het reconstrueren van de 3D-afbeelding (Figuur 4film 1).
-
Time-lapse beeldvorming van caspase BiFC
- Ten minste 1 uur vóór het experiment, zet de Microscoop en de temperatuur instellen tot 37 ° C.
- Selecteer de 40 x 60 x en 63 x olie doelstelling en breng een druppel olie op het doel.
- Plaats de schotel van cultuur in het werkgebied van de microscoop met behulp van de juiste plaat houder.
- Als een CO2 bron beschikbaar is, plaatst u de CO2 -levering apparaat (meestal een plexiglas deksel aangesloten op de buis van Eustachius de CO-2 levert) op de top van de houder van de plaat. De CO2 -niveau ingesteld op 5% en inschakelen van de CO2 -controller van binnen de software. Als een CO2 bron niet beschikbaar is, ook 20 mM Hepes buffer media.
- Navigeer naar een gebied van transfected cellen en visualiseer het live beeld van de cellen als verworven door de camera en weergegeven door de acquisitie software op het computerscherm met behulp van de laser van RFP.
- Volgende stappen 4.2.8-4.2.12, ingang de instellingen voor percentage laser macht en blootstelling tijd voor de RFP-laser. Deze waarden zo laag mogelijk houden terwijl nog bekwaam om te ontdekken de fluorescent signaal.
- Met behulp van een positieve controle proeven (Zie tabel 3 voor voorbeelden), volg stappen 4.2.8-4.2.12 aan de ingang van de instellingen voor percentage laser macht en blootstelling tijd voor de YFP laserlicht. Deze waarden zo laag mogelijk houden terwijl nog steeds kundig voor speurder Venus signaal.
- Kies voor elk putje van de plaat, een aantal verschillende posities met een of meer cellen, uiting geven aan de verslaggever.
- Voer het tijdsinterval tussen elk frame van de time-lapse en het totale aantal frames moeten worden genomen. Zorgen er is tijd om alle geselecteerde posities te verwerven voordat het volgende frame dient te worden genomen.
- Elke positie opnieuw te bezoeken en corrigeren en bijwerken van de focus zo nodig.
- Zet de focus drift correctie systeem (indien beschikbaar) om te corrigeren voor focal drift die kan ontstaan door veranderingen in temperatuur of externe trillingen.
- Beginnen de time-lapse en sla de gegevens.
- Het analyseren van de gegevens met behulp van verkrijgbare imagingsoftware (Figuur 5Movie 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van caspase-2 BiFC geïnduceerd door DNA-beschadiging is afgebeeld in Figuur 3. Camptothecine, een topoisomerase ik inhibitor, werd gebruikt voor het opwekken van DNA-schade en caspase-2-activering. Het rood fluorescerende eiwit-mCherry werd gebruikt als een verslaggever om te tonen dat de cellen de BiFC sonde uiten en om te helpen visualiseren het totale aantal cellen. Venus fluorescentie wordt weergegeven in het groen en de grote puncta vertegenwoordigen caspase-2 geïnduceerde nabijheid. Deze cellen kunnen worden geteld om te bepalen van het percentage van Venus-positieve cellen. Conclusies over subcellular localisatie kunnen ook worden gemaakt van dergelijke beelden. In het voorbeeld, werd geïnduceerde nabijheid van caspase-2 ontdekt in de nucleolus zo goed als in het cytoplasma 17. Om hoge resolutie visualisatie van de subcellular localisatie van de complexe activering van caspase, kunnen de afzonderlijke cellen worden beeld in drie dimensies. Figuur 4 ziet u twee manieren om te geven dergelijke 3D beelden. De eerste is het genereren van een 3D reconstructie van de cel. Het voorbeeld toont camptothecine-geïnduceerde caspase-2 BiFC in groen en kern in het rood. De 3D reconstructie toont de relatieve lokalisatie van beide fluorophores in de cellen. Dit type display van de resultaten is vooral effectief wanneer gepresenteerd als een film, draaien de cel rond een enkele as (film 1). Het tweede paneel is de orthogonale weergave van dezelfde cel. Dit biedt de xy-, xz- en yz visualisatie van de cel op een bepaald punt in de cel. Voorstelling van de resultaten op deze manier kunnen meer geschikt voor de presentatie van een papier zoals in een tijdschriftartikel zoals het is gemakkelijker om het interpreteren van de 3D-gegevens gepresenteerd in een 2D-formaat. Figuur 5 toont een voorbeeld van time-lapse beeldvorming van caspase-2 BiFC in een cellijn van glioblastoma met het proteasoom remmer bortezomib behandeld (Zie ook Movie 2). De grafiek toont de toename in de gemiddelde intensiteit van de Venus per cel gemiddeld over een aantal cellen (aangepast van 20). Dit soort gegevens kan ook worden weergegeven als een getal van eencellige sporen op een grafiek. In het voorbeeld, is het begin van caspase geïnduceerde nabijheid ongeveer 2 uur na de behandeling.
Figuur 1: schematische van caspase-structuur en bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) methodologie. (A) algemene structuur van een initiatiefnemer caspase. De prodomain, grote en kleine subeenheden en het geconserveerde QACRG motief waarin de actieve site cysteïne zijn afgebeeld. (B) BiFC maakt gebruik van split fluorescente proteïnen die alleen niet tl maar voor de hervorming van het fluorescerende molecuul wanneer gesmolten aan interacterende eiwitten kunnen koppelen. Voor caspase BiFC, de prodomain (Pro) of full-length caspase half aan de N-terminal is gesmolten (Venus-N) en aan de C-terminal helft (Venus-C) van Venus. In hun monomeer staat zijn de caspase-fusie-eiwitten niet tl. Bij aanwerving naar een activering-platform, zoals de PIDDosome, zoals hier is afgebeeld, wordt vereniging van de twee helften van Venus afgedwongen caspase geïnduceerde nabijheid dat wordt gemeten als een verhoging in Venus fluorescentie vertegenwoordigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatief beeld voor het herkennen van verzadiging met behulp van het histogram weergegeven. Voorbeelden van optimale (bovenste) en verzadigde signalen (lagere paneel) worden weergegeven. De Venus (gele piek) en RFP (rode piek) signalen worden weergegeven. De x-as geeft de intensiteit en de y-as is het aantal pixels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Caspase-2 bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) na DNA-beschadiging. HeLa cellen uiten van de onderdelen van de BiFC caspase-2 werden verlaten onbehandeld (A) of (100 µM) camptothecine behandeld (B) in aanwezigheid van qVD-Ophiuchi (20 µM). mCherry was mede uitgedrukt in een fluorescerende verslaggever. Representatieve beelden tonen cellen (rood) met caspase-2 BiFC (groen) in camptothecine behandelde cellen 16 h na de behandeling. Schaal staven 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: lokalisatie van caspase-2 bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC). HeLa cellen, uiting geven aan de onderdelen van caspase-2 BiFC en een fluorescerende nucleaire verslaggever werden behandeld met (20 µM) camptothecine in aanwezigheid van qVD-Ophiuchi (20 µM). 3D-reconstructies samengesteld uit 0,1 μm seriële confocal beelden t/m het z-vlak van de cel werden gemaakt na 24 h en de kern in rood en caspase-2 BiFC in het groen weergeven. Het linker paneel toont een 3D maximale intensiteit projectie rendering reconstructie (Zie ook film 1). Het juiste paneel wordt de weergave van de orthogonale segmenten van dezelfde cel weergegeven. Het middelste vak (blauw) is de xy -oppervlakte, in het vak rechtsonder (geel) is het yz -vlak en (witte)-top box is het xz -vlak. De yz en xz vliegtuigen elkaar snijden volgens de dradenkruis. Schaal staven 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Time-lapse van caspase bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) (A) LN18 glioblastoma cellen transfected met de onderdelen van caspase-2 BiFC en een rode fluorescerende mitochondriale marker (DsRed-mito, rode) werden behandeld met bortezomib (15 nM) in aanwezigheid van qVD-Ophiuchi (20 µM). De cellen werden geplaatst op een confocal microscoop bij 37 ° C en de beelden werden genomen elke 2 min voor 8 h. beelden van representatieve cellen uit de time-lapse tonen aan dat de geïnduceerde nabijheid van de twee onderdelen van caspase-2 BiFC in een stijging in Venus fluorescentie ( resulteerden groene) na verloop van tijd. (B) de gemiddelde intensiteit van Venus in elke cel op elk punt van de tijd werd gemeten. Venus fluorescentie verhoogd na verloop van tijd na bortezomib behandeling. Divisie in het onbehandelde besturingselement aangegeven laag of verwaarloosbaar toxiciteit voorwaarden van laserlicht (figuur aangepast van 20). Schaal bars vertegenwoordigen 20 µm. foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van 8 (control) en 14 (bortezomib) afzonderlijke cellen (Zie ook Movie 2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Grootte van de plaat | Aantal cellen | Volume van media |
| 6 goed plaat | 1 x 105 cellen / goed | 2 mL |
| 12 goed plaat | 5 x 10,4 cellen / goed | 1 mL |
| 24 goed plaat | 2.5 x 104 cellen / goed | 0,5 mL |
| 4 kamer schotel | 2.5 x 104 cellen / kamer | 1 mL |
| 8 kamer schotel | 1.25 x 104 cellen / kamer | 0,5 mL |
Tabel 1: richtsnoeren voor aantallen cellen aan plaat. Als cuvetten stabiel het uitdrukken van de componenten van caspase bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC), dubbele plaat van de hier vermelde bedragen.
| Grootte van de plaat | Transfectiereagens | Verminderde serum media | Verslaggever plasmide | Caspase-pro VC plasmide | Caspase-pro VN plasmide | Verminderde serum media toegevoegd aan plasmide mix | Transfectie reagens oplossing toegevoegd aan plasmide mix | Vrije media serum toegevoegd aan cellen |
| 6 goed plaat | 12 µL/plaat | 750 ΜL | 10 ng | 20 ng | 20 ng | aan totale 100 µL | 100 ΜL | 800 ΜL |
| 12 goed plaat | 12 µL/plaat | 750 ΜL | 5 ng | 10 ng | 10 ng | aan totale 50 µL | 50 ΜL | 400 ΜL |
| 24 goed plaat | 12 µL/plaat | 750 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | aan totale 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 4 kamer schotel | 4 µL/plaat | 250 ΜL | 2.5 ng | 5 ng | 5 ng | aan totale 25 µL | 25 ΜL | 200 ΜL |
| 8 kamer schotel | 4 µL/plaat | 250 ΜL | 1,25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | op totaal 12,5 µL | 12.5 ΜL | 100 ΜL |
Tabel 2: aanbevolen hoeveelheden voor voorbijgaande transfectie gebruikte reagentia. Nota: het bedrag van de plasmide voorgesteld is slechts een uitgangspunt. Als er geen signaal is gevonden, is het aanbevolen om Titreer de plasmide van 20-200 ng per putje van de plaat van een 6-well.
| Caspase | Behandeling | Concentratie | Tijd | Verwachte resultaten |
| Caspase-1 | Overdreven uitgedrukt ASC | 250 ng/putje van een 6 goed plaat | 48 h | 50% BiFC positief |
| Caspase-2 | Overdreven uitgesproken RAIDD | 500 ng/putje van een 6 goed plaat | 24 h | 90% BiFC positief |
| Camptothecine | 100 ΜM | 16 h | 30-60% BiFC positief | |
| Warmte schok | 1 h bij 45 ° C | 16 h | 80% BiFC positief | |
| Caspase-4 | Overexpressie NALP1 | 250 ng/putje van een 6 goed plaat | 48 h | 30% BiFC positief |
| Caspase-5 | Overexpressie IPAF | 250 ng/putje van een 6 goed plaat | 48 h | 15% BiFC positief |
Tabel 3: voorbeelden van positieve controles voor caspase bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC). De voorwaarden en de verwachte resultaten zijn gebaseerd op de gepubliceerde gegevens met behulp van de Pro construeert 14,17,18. Co uitgedrukt plasmiden moeten zijn transfected naast de BiFC plasmiden (stap 2.1.4)
Film 1: 3D lokalisatie van caspase-2 bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC). 3D reconstructie, geroteerd rond de y-as van de confocal beelden t/m het z-vlak van een Hela cellen uiten de caspase-2-BiFC-onderdelen en een fluorescerende nucleaire verslaggever werden behandeld met (20 µM) camptothecine voor 16 h. De film toont caspase-2 BiFC (groen), en de kern (rood). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: Time-lapse van caspase-2 bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC). LN18 glioblastoma cellen transfected met de onderdelen van caspase-2 BiFC en behandeld met bortezomib (15 nm) waren beeld elke 2 min voor 8 h. De film toont caspase-2 BiFC (groen), en de mitochondriën (rood). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol bespreekt het gebruik van split fluorescerende eiwitten voor het meten van caspase geïnduceerde nabijheid. Split Venus werd gekozen voor deze techniek, omdat het is zeer helder, zeer photostable en de uiteinde is snel 13. Dus, de analyse van Venus uiteinde op caspase geïnduceerde nabijheid kan bieden bijna real-time schattingen van caspase-eiwit interactie dynamiek. Venus is opgesplitst in twee iets overlappende fragmenten, het N-terminus van Venus (Venus-N of VN) aminozuren bestaande uit 1-173 en de terminal C fragment (Venus-C of VC) bestaande uit residuen 155-239. Andere split fluorescerende eiwitten bestaan, maar dat sommige, zoals split mCherry, incubatie bij 4 ° C voor maximaal 2 uur voor het uiteinde van 21. Extra split fluorescente proteïnen Cerulean (een versie van cyaan fluorescent proteïne) met inbegrip van split en de mLumin veel rode split nog moeten worden getest in dit kader 13,22. Uiteindelijk, als deze fluorescente proteïnen geschikt blijken voor het meten van caspase geïnduceerde nabijheid, dit kan leiden tot de gelijktijdige evaluatie van meerdere caspases.
In het algemeen is de prodomain (Pro)-regio van de caspase gesmolten tot de split fluorescerende fragmenten. Deze regio bevat de minimale gedeelte van de caspase nodig om aan het platform van de activering te binden en omvat het CARD of DED interactie motief. Het voordeel van het gebruik van de prodomain is dat het geen een enzymatische activiteit aan de cellen worden geïntroduceerd. Dit zorgt voor de gelijktijdige bewaking van downstream gebeurtenissen als gevolg van de endogene caspase. Onderzoek tot op heden blijkt weinig verschil in de kinetiek en lokalisatie van caspase BiFC tussen de prodomain en de volledige lengte caspase 14. Echter, de full-length constructies neiging om uit te drukken met een lager rendement, waardoor de transfectie van grotere hoeveelheden plasmide DNA. Daarnaast is het aanbevolen om het muteren van de katalytische cysteïne tot een serine om te voorkomen dat caspase-veroorzaakte apoptosis op expressie. Ondanks deze nadelen, kunnen bepaalde onderzoeken de gelijktijdige analyse van de volledige lengte BiFC paren om te bepalen of er context-afhankelijke verschillen in de nabijheid van de caspase veroorzaakte in de aan- of afwezigheid van de katalytische domeinen vereist.
Dit protocol is speciaal aangepast voor HeLa cellen. Hetzelfde protocol werkt goed voor extra aanhangend cellijnen, met inbegrip van de borstklier carcinoom cellijn MCF-7, glioblastoma cellijn, LN18 en muis embryonale fibroblasten (MEF). Het wordt aanbevolen dat de gebruiker zowel de beplating en de transfectie voorwaarden optimaliseert bij de aanpassing van dit protocol aan een nieuw celtype. Het protocol beschrijft twee belangrijkste microscopie benaderingen die kunnen worden gebruikt om te evalueren van de cellen: epifluorescence en confocale microscopie. Bij het gebruik van confocale microscopie, moeten cellen worden verguld op glas coverslips omdat de meerderheid van de hoge numerieke diafragma doelstellingen die worden gebruikt in combinatie met confocale microscopie niet in de dikte van de kunststof gerechten of glas dia's doordringen zal. Dus, is het aanbevolen gerechten met ingesloten no. 1.5 glazen coverslips die de dikte van de optimale dekglaasje aan van 0,17 mm hebben. Een aantal verschillende soorten van deze gerechten zijn beschikbaar die variëren van individuele 3 cm gerechten, op dia's kamer, op standaardgrootte multi goed platen. Tabellen 1 en 2 een overzicht van hoe aan te passen de beplating en transfectie instructies voor de verschillende goed formaten. Voor de epifluorescence hier imaging dat is beschreven (4.1), de standaard kunststof weefselkweek platen zijn voldoende zolang de Microscoop is uitgerust met lange pass doelstellingen.
Omdat deze aanpak is in feite een "lichten op" methode voor het meten van de activering van caspase, is de opneming van een fluorescerende verslaggever essentieel zowel toestaan visualisatie van de cellen voorafgaand aan, of bij gebreke van activering van de caspase-verslaggever en identificeren de transfected cellen, bij het voorbijgaande transfectie wordt gebruikt. Een aantal verschillende verslaggevers kan worden gebruikt en de enige criteria bij het kiezen van een zijn: 1) de fluorophore is voldoende helder zodat dit gemakkelijk kan worden gedetecteerd door het imaging protocol; en 2) zijn fluorescerende spectrum overlapt niet met die van YFP. Bijvoorbeeld, mag groen fluorescente proteïne (GFP) niet dienen als een verslaggever omdat het zal worden gedetecteerd door de YFP filter of laser gebruikt voor het opsporen van Venus. Dit is te wijten aan de spectrale overlap tussen de twee fluorophores. Het kiezen van een fluorophore die aan een specifieke organel lokaliseert kan aanvullende kwalitatieve informatie verschaffen. Bijvoorbeeld gebruik van een eiwit dat doelstellingen de mitochondriën, zoals de rode fluorescent proteïne DsRed-mito, extra informatie over de algehele levensvatbaarheid van de cel verschaffen kunnen. Mitochondriën neiging om ondergaan om versnippering (kernsplijting) tijdens de vroege stadia van cel dood 23 en dit met een verslaggever zoals DsRed-mito kan worden gevisualiseerd. Het gebruik van een organel markering als een verslaggever kunnen ook conclusies over subcellular localisatie van caspase BiFC worden gemaakt.
Er zijn een aantal manieren dat caspase BiFC gegevens kan worden verworven en geanalyseerd. Beslissen welke methode zal worden bepaald door de parameters worden onderzocht (eindpunt bevolking analyse versus eencellige positionele of kinetische informatie) en de beschikbaarheid van instrumentatie en beeldbewerkingssoftware. Dit protocol beschrijft een paar Microscoop gebaseerde benaderingen van de resultaten van een caspase BiFC experiment voor het verwerven van enkele tijdstippen zowel time-lapse gegevens verzamelen. Er moet echter worden opgemerkt dat een aantal variaties en combinaties van deze benaderingen worden gebruikt om creatief ondervragen caspase activering trajecten.
Enige tijd punt data-acquisitie (4.1) is gebruikt om te bepalen van het percentage cellen met caspase geïnduceerde nabijheid op een enkel tijdstip. Voor dit protocol telt een gewoon het aantal transfected cellen dat Venus-positief zijn. Dus, gespecialiseerde uitrusting is niet vereist en alleen de meest elementaire epifluorescence Microscoop met een GFP (of YFP) en RFP filter en een hand tally teller nodig is. Sommige imaging systemen kunnen worden geautomatiseerd om automatisch een bepaald aantal afbeeldingen per putje van een plaat. Als dergelijke instrumentatie beschikbaar is, de cellen in de verworven beelden op dezelfde manier kunnen worden geteld door visuele inspectie, of quantitated met behulp van beeldbewerkingssoftware. Driedimensionale beeldvorming (4.2) levert hoge resolutiebeelden van caspase BiFC gedurende de focal vliegtuigen van de cel. Een confocal microscoop met lasers die prikkelen Venus en RFP (of de gekozen transfectie verslaggever) en Z-stack mogelijkheden is vereist. Een aantal 3D-rendering softwaremodules zijn beschikbaar die bieden verschillende manieren om te visualiseren van de gegevens. Voor beide deze soorten analyse is het mogelijk te herstellen de cellen en de afbeelding of in een later stadium te beoordelen. Echter, het proces van fixatie doet af aan het signaal van Venus, dat artefacten aan de analyse toevoegen kan en deze benadering wordt daarom niet aangeraden. Time-lapse imaging (4.3) kan worden gebruikt om gelijktijdige kinetische en positionele analyse van caspase BiFC. Een microscoop voorzien van een gemotoriseerde fase kan worden ingesteld zelfs vergelijken verschillende behandelgroepen in hetzelfde experiment te nemen beelden van meerdere posities.
Voor time-lapse, een aantal aanvullende overwegingen rekening moet worden gehouden. Het laserlicht kan leiden tot artefacten als gevolg van fototoxiciteit of photobleaching en beide moeten worden gecontroleerd voor. In het algemeen, kunnen zowel worden vermeden door gebruik te maken van de laagst mogelijke hoeveelheid licht (ingang laag percentage laser macht en korte belichtingstijden in stappen 4.3.6-4.3.7). Fototoxiciteit resultaten wanneer het laserlicht dood in de cellen induceert en voor kan worden gecontroleerd door imaging onbehandelde cellen onder dezelfde voorwaarden en bevestiging van dat die celdeling opbrengst als normaal. Photobleaching treedt op wanneer meerdere opnamen van dezelfde cel vermindert de fluorescentie. De Venus fluorescent proteïne is heel photostable, dus dit zelden een probleem in de praktijk is. De effecten van photobleaching kunnen worden bepaald door de vele opeenvolgende opnamen van een Venus-positieve cel en ervoor te zorgen dat de fluorescentie stabiel blijft. Dit moet alleen worden gedaan eenmaal, zolang dezelfde laser macht en blootstelling instellingen worden gebruikt voor elk experiment. Effecten als gevolg van fototoxiciteit of photobleaching kunnen ook worden verzacht door vermindering van het totale aantal beelden. Dit kan worden bereikt door de verlenging of verkorting van het tijdsinterval tussen vangt (stap 4.3.9). Gebruik van 5-10 min. intervallen over een time-lapse 16u is een goede plaats om te beginnen. Als geen photoxicity is waargenomen of experimenten van kortere duur vereist zijn, kan het interval tussen frames worden verminderd. Als de activering van caspase snel, kunnen kortere experimenten met kortere tijdsintervallen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, voor een 16 h-experiment met 10 min. intervallen, zullen een totaal van 192 beelden worden genomen (96 voor elke fluorophore). Een experiment 2 h met 1,5 m intervallen zal 160 beelden opleveren. Dus, de lange en korte experimenten zou elk bloot de cellen te soortgelijk totaalbedragen van laserlicht. Voor korte duur experimenten kan de caspase activeren stimulans rechtstreeks naar de media onmiddellijk voorafgaand aan de inleiding van de time-lapse opname (na stap 4.3.11 in plaats van bij stap 3) worden toegevoegd. Om dit te doen, en verwijder het deksel van de plaat en zachtjes laten vallen in een oplossing met de prikkel die met behulp van een precisiepipet. Wees voorzichtig niet te drummen van de plaat en snel controleren dat de cellen nog steeds in focus voordat u verdergaat zijn.
Bij het uitvoeren van time-lapse experimenten, is het ook essentieel om ervoor te zorgen dat de onmiddellijke omgeving van de cellen sterk lijkt op die van een weefselkweek incubator. Een aantal milieu besturingselementen zijn beschikbaar op verschillende Microscoop set ups. Het gaat hierbij om kleinere fase top starterscentra evenals milieu kamers die de gehele Microscoop insluiten. Beide apparaten leveren meestal warmte, CO2, en vochtigheid aan de zaal op een manier die nauwkeurig kan worden gecontroleerd. De nauwkeurige controle van CO2 en temperatuur is essentieel voor het succes van het experiment omdat onverwachte temperatuur schommelingen tot focal drift en afwezigheid van CO2 leiden kunnen zorgt ervoor dat de pH van het medium te stijgen dat giftig voor de cellen kunnen. Als een CO2 -bron niet beschikbaar is, kunnen de media worden gebufferd door toevoeging van Hepes (zie stap 3.1.1). Zelfs als een CO2 bron beschikbaar is, is het aanbevolen om het imaging medium Hepes onder als een extra beveiligingsmaatregel de cellen om gezond te houden. Zelfs in aanwezigheid van Hepes, het ontbreken van CO2 voor langdurig van tijd kan echter leiden tot celdood. Daarom is het belangrijk om te inspecteren van onbehandelde cellen, beeld onder dezelfde voorwaarden, en de kleur van de media aan het einde van het experiment om ervoor te zorgen dat de pH stabiel is gebleven. Merk op dat fenol red hoeft niet te worden weggelaten uit een van de media in dit protocol wordt gebruikt, aangezien de bijdrage van autofluorescence aan het signaal van Venus minimaal is.
Er zijn een aantal van de beschikbare methoden om de beeldvorming gegevens als gevolg van een time lapse experiment te analyseren. Het meten van de gemiddelde intensiteit van Venus pixels per transfected cel is de meest eenvoudige manier om te analyseren de timing van caspase geïnduceerde nabijheid. Zoals blijkt uit Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, wordt vaak de caspase-2 BiFC weergegeven als een of meer puncta gelegen in verschillende subcellular compartimenten. Analyse Imaging benadert dat maatregel aantallen foci, grootte van het object, of andere soortgelijke factoren informatieve kwantitatieve gegevens over deze structuren kan opleveren. Niet alle caspase BiFC weergegeven als puncta. De inflammatoire caspases hebben bijvoorbeeld verschillende BiFC patronen met inbegrip van de diffuse fluorescentie, draadvormige structuren en één of meerdere puncta per cel 18aangetoond. Deze patronen waren afhankelijk van de caspase evenals de upstream activerend signalen geactiveerd. De soort analyses die meest geschikt is voor de time-lapse resultaten zal daarom grotendeels worden gedicteerd door het soort fluorescente patronen die wordt waargenomen.
Veel van de behandeling stimuli die worden beoordeeld wanneer apoptosis of rechtstreeks via de caspase geanalyseerd, of indirect door een andere cel dood weg met behulp van dit protocol zal veroorzaken. Dit zorgt ervoor dat de cellen te krimpen en loskoppelen van de plaat, waardoor het erg moeilijk om het imago van de cellen en bijna onmogelijk om te bepalen van elke specifieke lokalisatie van de caspase-BiFC. Opneming van een pan-caspase-remmer wordt voorkomen dat deze celdood. De aanwerving van caspases hun activering platformen en de bijbehorende caspase BiFC is niet afhankelijk van de katalytische activiteit van het caspase. Daarom caspase remming zal geen invloed hebben op deze stap, maar zal remmen de stroomafwaarts van de fysieke kenmerken van apoptosis blebbing, detachement, alsmede eventuele verlies in plasma membraan integriteit. Dus, als het verrichten van eindpunt analyse (stap 4.1) of Z stapels (stap 4.2), de toevoeging van een inhibitor caspase is essentieel. Voor time-lapse daarentegen experimenten als apoptosis-gerelateerde evenementen zoals MOMP, Annexine V binding (met detect fosfatidyl serine blootstelling) of propidium jodide opname (om te detecteren plasmamembraan permeabilization) moeten worden geanalyseerd naast caspase BiFC, de Caspase-remmer moet worden weggelaten om te voorkomen dat inhibitie van deze gebeurtenissen. Een inhibitor caspase zoals qVD-Ophiuchi (10-20 µM) moet worden toegevoegd aan in de media waarin de stimulus van apoptose-inducerende (stap 3.1.1). Als mede uiting geven aan een proteïne van de pro-apoptotic caspase BiFC onderdelen, worden de caspase-remmer bij stap 2.1.12 toegevoegd.
Terwijl caspase BiFC één van de weinig beschikbare methoden die kunnen worden gebruikt om te visualiseren gebeurtenissen in caspase activering trajecten in levende cellen is, moet een aantal overwegingen rekening worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. Omdat deze aanpak overexpressie gebaseerde, zijn controles voor specificiteit belangrijk. Dit kan op twee manieren worden bereikt. Eerst moet binnenbrengen van één puntmutaties de kaart of DED van de prodomain zodat zij de binding tussen de caspase en haar platform activering verstoren caspase dalen zowel de intensiteit van caspase BiFC en het percentage van Venus-positieve cellen. Bijvoorbeeld mutatie van het residu D59 tot en met E in de prodomain van caspase-1 verstoort binding aan de adapter proteïne ASC (apoptosis-geassocieerde speck-achtige eiwitten met een kaart) en even verstoort ASC-geïnduceerde caspase-1 BiFC 18,24 . Ten tweede, gebruik van cellen die zijn tekort aan de adaptor eiwitten die de caspase aan het platform van de activering werven zal dalen specifieke BiFC signalen. Dit kan worden bereikt met behulp van knock-out cellen, indien beschikbaar, of het gebruik van siRNA of CRISPR/Cas9 gebaseerde benaderingen om het afbreken van de cellen van de adapter. Dienovereenkomstig, uitputting van het caspase-2 adapter eiwit RAIDD volledig geblokkeerd caspase-2 BiFC geïnduceerd door warmte schok of DNA schade 14,17. Voor deze experimenten, de knock-out of de vechtpartij cellen moeten worden vergeleken met de overeenkomende controle cellen (d.w.z. nest-matched wild type MEF of besturingselement vechtpartij cellen) en, als een nieuwe cellenvariëteit wordt gebruikt, optimale transfectie voorwaarden dient te worden beoordeeld om te zorgen voor gelijke expressie van de verslaggever van de BiFC over cellijnen.
Een tweede beperking van deze aanpak is dat, wanneer met behulp van voorbijgaande transfectie, is het moeilijk om ervoor te zorgen dat elke cel is het uiten van gelijke hoeveelheden van elk eiwit. Als expressie ongelijke een, kon één Venus fragment aan het platform bij hogere frequenties worden aangeworven. Dit kan maskeren de volledige fluorescent signaal en leiden tot vals-negatieve resultaten. Om dit probleem te verhelpen, heeft een nieuwe versie van de caspase BiFC verslaggever voor stabiele cel lijn generatie onlangs gemelde 17was. Deze nieuwe versie bestond uit een constructie waarbij de C2 Pro-BiFC-onderdelen op een enkele open leesraam gescheiden door de virale 2A zelf verbrijzelen peptide 25uitgedrukt. Daarom zijn de onderdelen BiFC getranscribeerd als een één mRNA van de dezelfde promotor maar vertaald voor de productie van de stoichiometrically gelijke hoeveelheden van de VC en VN fusie-eiwitten. De cellijnen gegenereerd als u stabiel uitdrukken deze constructie aangetoond vergelijkbare trends van activering aan de Transient uitgedrukt verslaggevers maar waren zowel gevoeliger en weergegeven lagere achtergrond fluorescentie. Dus, het bovenstaande protocol kan worden sterk vereenvoudigd als gebruikt in combinatie met verslaggever cellijnen die stabiel uitdrukking geven aan de caspase BiFC onderdelen.
Gegevens tot op heden blijkt minimale interferentie tussen de caspase-BiFC-onderdelen en de endogene eiwitten. Bijvoorbeeld caspase-2 is bekend om zijn geactiveerd stroomopwaarts van MOMP maar caspase-2 BiFC heb niet blokkeren de progressie van MOMP 14. Deze verslaggevers lijken dus niet te handelen op een dominante negatieve manier. Echter als gelijktijdig evaluatie downstream gebeurtenissen, moet dit onderzocht worden binnen elke set van experimenten. Met inbegrip van een besturingselement niet-transfected goed in de experiment is de beste manier om dit te benaderen. Als de kinetiek van celdood gewijzigd met of zonder expressie van de caspase-sensor zijn, zal dit erop wijzen dat de caspase-BiFC componenten niet met endogene functie bemoeien ons. Daarentegen kan de endogene caspase eventueel de BiFC uitlezing, beïnvloeden efficiëntie of in de grootte of vorm van de structuren. Uitdrukken van de verslaggever in cellen tekort voor de caspase zullen hiervoor beheersen.
Ondanks deze beperkingen is het caspase BiFC techniek een handige methode om te ondervragen caspase activering trajecten die kunnen aanvullen en zelfs op bestaande benaderingen voor het meten van de initiatiefnemer caspase activering te verbeteren. Door meten geïnduceerde nabijheid, de eerste stap in activeren, overwint deze techniek problemen in verband met het meten van de latere stappen zoals caspase auto-verwerking activering is gekoppeld. Bijvoorbeeld, terwijl het gebruiken van westelijke vlek te controleren van de splitsing van de beul caspases, biedt caspase-3 en caspase-7, een nauwkeurige maatstaf van activering 2, met behulp van dezelfde benadering voor initiator caspases kan worden ontsierd. Dit is omdat de splitsing van de caspases van de initiatiefnemer, volstaat niet voor activering 4,26,27. In feite, veel caspases van de initiatiefnemer zijn gekloofd tijdens apoptosis door caspase-3 zonder actieve enzymen 28produceren. Technieken die zijn gebaseerd op het gebruik van peptide substraten ontworpen als doelen voor specifieke caspases moeten ook rekening worden gehouden met overlappende kenmerken van deze sequenties voor de caspases 29. Dit betekent niet dat een dergelijke aanpak kunnen niet worden gebruikt voor het meten van de activering van caspase, maar de nadelen moeten worden erkend bij de interpretatie van de resultaten. Caspase BiFC biedt een alternatieve benadering die kan helpen bij het bevestigen van resultaten met meer conventionele methoden. Daarnaast is de mogelijkheid om bij te houden van de vergadering van de complexen van de activering van caspase in real-time en duidelijk bepalen de grootte, de vorm en de lokalisatie van de complexen een belangrijk voordeel van deze techniek die is het niet mogelijk te beoordelen op een andere manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij willen alle eerdere leden van de lab Bouchier-Hayes die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek te erkennen. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een Texas kinder ziekenhuis Pediatric Pilot award naar LBH. Wij danken Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) voor toestemming om te nemen van de gegevens gepubliceerd in samenwerking met haar team. De ontwikkeling van de reagentia die beschreven werd gesteund door het Cytometry en de cel Sorteren kern aan Baylor College of Medicine met financiële steun van de NIH (NIAID P30AI036211, NCI, P30CA125123 en NCRR S10RR024574) en de hulp van Joel M. Sederstrom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J.
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S.
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M.
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don't know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
