Das MPLEx-Protokoll für Multi-Omic Analysen von Bodenproben
Summary
Ein Protokoll ist für gleichzeitig Extrahieren von Metaboliten, Proteine und Lipide aus einer einzigen Bodenprobe, ermöglicht reduzierte Probe Zubereitungszeiten und ermöglicht Multi-Omic Massenspektrometrie Analysen von Proben mit begrenzten Mengen vorgestellt.
Abstract
Massenspektrometrie (MS)-auf der Grundlage integrierter metaproteom, Metabolomic und Lipidomic (Multi-Omic) Studien verändern unsere Fähigkeit zu verstehen und mikrobielle Gemeinschaften in ökologische und biologische Systeme zu charakterisieren. Diese Messungen ermöglichen erweiterte Analysen komplexer Boden mikrobieller Gemeinschaften, die die meisten sind sogar komplexe mikrobielle Systeme bisher bekannt. Multi-Omic Analysen haben jedoch Probe Vorbereitung Herausforderungen, da separate Extraktionen für jede Omic Studie, dadurch erheblich verstärken die Zubereitungszeit und Probenmenge benötigt in der Regel benötigt werden. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde eine 3-in-1-Methode für die gleichzeitige Gewinnung von Metaboliten, Proteinen und Lipiden (MPLEx) aus der gleichen Bodenprobe durch Anpassung einen Lösungsmittel basierender Ansatz geschaffen. Dieses Protokoll MPLEx erweist sich als einfach und robust für viele Probentypen sein, auch wenn für begrenzte Mengen von komplexen Bodenproben genutzt. Die MPLEx-Methode aktiviert auch die schnelle Multi-Omic Messungen erforderlich, um ein besseres Verständnis der Mitglieder der einzelnen mikrobiellen Gemeinschaft bei der Auswertung der Veränderungen auf biologische und ökologische Störungen.
Introduction
Bewertung von Boden mikrobiellen Gemeinschaften hat wichtige Implikationen für Kohlenstoff Radfahren und Klima Wandel verstehen. Neuere Studien haben jedoch Schwierigkeiten, wie das Fehlen von sequenzierten Genome für Mikrobiota in verschiedenen Bodenarten und die unbekannte Funktion vieler Proteine erkannt hervorgehoben. Diese Herausforderungen ergeben sich aufgrund der Boden der komplexesten mikrobiellen Gemeinschaft bekannt,1,2,3bis heute. Multi-Omic Analysen, die Ergebnisse von metagenomischen, Metatranscriptomic, metaproteom, Metabolomic und Lipidomic Studien zu verbinden, wurden in zahlreichen Studien der Erde zu einem besseren Verständnis in die Mikroben vorhanden, während vor kurzem umgesetzt erhalten umfassende Informationen über die molekulare Veränderungen aufgrund von ökologischen Störungen1,4,5. Eine Herausforderung mit Multi-Omic Studien ist, dass der Massenspektrometrie (MS)-auf der Grundlage metaproteom, Metabolomic und Lipidomic Messungen erfordern in der Regel eine spezielle Extraktionsverfahren für jedes Omic MS kompatibel6,7 , 8 , 9. präzise Gestaltung dieser Verfahren deren Umsetzung äußerst schwierig oder unmöglich wenn nur eine begrenzte Menge der Probe zur Verfügung steht. Diese Herausforderungen haben uns eine gleichzeitige Metabolit, Protein- und Lipid-Extraktion (MPLEx) Methode in der Lage, mit Hilfe kleiner Probenmengen oder Massen, Verbesserung der Genauigkeit und Bereitstellung schnellere Probe Vorbereitungen für alle drei Analysen untersuchen veranlasst 10. bislang gibt es keine alternativen Boden Extraktionsverfahren, die alle diese Ziele erreichen können.
Um globale Multi-Omic Analysen von einer einzigen Bodenprobe zu ermöglichen, war ein Bio solvent-Extraktion-Protokoll basierend auf Chloroform, Methanol und Wasser Trennungen eingesetzten10. Diese Methode wurde ursprünglich für den gesamten Lipid Extraktionen9,11 und wurde vor kurzem geändert, für die gleichzeitige Gewinnung von Metaboliten, Proteine und Lipide aus einer einzigen Probe12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, so dass weniger Probenmenge und experimentelle Variabilität10. Im Protokoll von MPLEx ist Chloroform nicht mischbar mit Wasser, das die Grundlage für die triphasische chemische Trennung der Probe Bestandteile in verschiedene Fraktionen bildet. Die obere wässrige Phase enthält daher die hydrophilen Metaboliten, gefolgt von einem Protein-Datenträger und dann eine Lipidschicht in der unteren Chloroform Phase (Abbildung 1). Wenn MPLEx auf den meisten Böden angewendet wird, partikulären Schmutz sammelt sich ganz unten der Probenahme Röhren und kann weggeworfen werden, nachdem alle Schichten gesammelt werden. Jede Bodenart kann abweichen, jedoch und in höchst organischen Böden wie Torf, der Boden Schmutz bleibt in der Mittelschicht und fällt nicht auf den Grund der Messgasleitung. MPLEx bietet mehrere Vorteile, wenn mehrere Molekül isolieren aus derselben Probe eingibt, wie (1) kleinere Probenmengen können verwendet werden, für Multi-Omic Analysen, 2) Multi-Omic Extraktionen aus der gleichen Probe Rückgang insgesamt experimentelle Variabilität und (3) größere Zahl von Proben können viel schneller für höheren Durchsatz Studien10vorbereitet werden. Zusammen sind diese Vorteile für eine bessere Messmöglichkeiten zur Bewertung von Bodenproben und deren komplexen mikrobiellen Gemeinschaften von entscheidender Bedeutung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle Laboratorien die gleiche Ausstattung haben werden, so dass bestimmte Methoden, zum Beispiel die Lyse Schritt, angepasst werden können. Hier verwenden wir aufschütteln und beschallen, aber die Verwendung eines großen 50 mL Wulst Beater funktionieren würde. Wenn ein Gefriertrockner mit einer in der Lage,-105 ° C Kollektortemperatur nicht verfügbar ist, können Proben unter einer Stickstoff-Stream getrocknet werden. Auch Bodenarten sind sehr unterschiedlich und können einsc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte Nathan Johnson für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Figuren zu danken. Diese Forschung wurde durch das Pan-Omics-Programm unterstützt, die vom U.S. Department of Energy Office von biologischen und Umweltforschung (genomische Science Program), die Mikrobiome im Übergang (MinT) Labor leitete Forschung und Entwicklung gefördert wird Initiative des Pacific Northwest National Laboratory, als auch die nationalen Institute of Health nationalen Institut der Environmental Health Sciences (R01 ES022190) und NIH (P42 ES027704). KEBJ möchte R21 HD084788 für die finanzielle Unterstützung zur Entwicklung und Validierung neuartiger Multi-Omic Extraktionstechniken danken. Diese Arbeit wurde in die W. R. Wiley Umwelt molekularen Wissenschaften Labor (EMSL), eine DOE nationalen wissenschaftlichen Benutzer Anlage am Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) durchgeführt. PNNL ist ein Multi-Programm-nationallabor für DOE unter Vertrag DE-AC06-76RL01830 von Battelle betrieben.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
Riferimenti
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