Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)
Summary
Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.
Abstract
La tuberculose est toujours des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Améliorations à des régimes médicamenteux existants et le développement de nouveaux traitements sont requis de toute urgence. La capacité des antituberculeux dosé d’atteindre et de stériliser des bactéries au sein des régions nécrotiques mal vascularisé (caseum) des granulomes pulmonaires est cruciale pour une intervention thérapeutique réussie. Régimes thérapeutiques efficaces doivent donc contenir médicaments ayant des propriétés de pénétration caseum favorable. Les méthodes actuelles de LC/MS pour quantifier les concentrations du médicament dans les tissus biologiques ont limité les capacités de résolution spatiale, rend difficile de déterminer avec précision les concentrations du médicament absolue dans les milieux de petits tissus tels que ceux trouvés dans les granulomes nécrotiques. Nous présentons ici un protocole associant microdissection de saisie de laser (LCM) des régions de tissus pathologiquement distinctes avec quantification de LC/MS. Cette technique fournit quantification absolue de la drogue au sein du Granulome caseum, entourant la lésion cellulaire et tissu pulmonaire non impliqués et, donc, avec précision détermine si des concentrations bactéricides sont réalisées. Outre la recherche de la tuberculose, la technique a de nombreuses applications potentielles pour résolue spatialement quantification des drogues dans les tissus malades.
Introduction
La capacité de résoudre dans l’espace et de quantifier les concentrations du médicament est une condition essentielle pour déterminer si des médicaments antituberculeux atteint sous-populations bactériennes au sein des lésions pulmonaires à des concentrations1de stérilisation. Une importance particulière consiste à déterminer la pénétration de drogue dans le noyau nécrotique de la lésion (appelée caseum), qui généralement contient le plus grand nombre de bacilles et qui peut être difficilement accessibles aux médicaments en raison de l’absence de vascularisation.
Les méthodes traditionnelles pour évaluer la pénétration de la lésion, qui impliquent l’homogénéisation des lésions pulmonaires excisées suivie d’extraction par solvant et l’analyse de spectrométrie de masse (LC/MS) de chromatographie en phase liquide, sont hautement sensible et sélectif pour les médicaments de intérêt. Cependant, ces méthodes offrent l’information spatiale pauvre, limitée à la taille du tissu original homogénéisé. Basé sur la spectrométrie de masse des approches d’imagerie, telles que matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI)2,3, désorption electrospray ionisation (DESI)4 ou extraction surface liquide-enhanced5, 6 offrent des capacités d’imagerie très résolue spatialement, mais quantification directe peut être extrêmement difficile, voire impossible en raison d’effets de suppression ion hétérogènes et différentes efficacité d’extraction de l’analyte de la cellule de divers types de tissu7ou. En outre, des approches d’imagerie tissulaire MS plus directes sont intrinsèquement moins sensibles que LC/MS en raison du manque de séparation chromatographique des espèces endogènes en compétition pour l’ionisation et l’efficacité d’extraction par solvant plus faible de la drogue du tissu.
Microdissection de saisie de laser (LCM) combinée à une analyse LC/MS a été systématiquement appliquée pour isoler et caractériser des regions tissulaires distinctes pour la protéomique étudie8,9 et récemment utilisée pour la quantification de la drogue en ayant reçu une dose 10de tissus d’origine animale. Nous présentons ici un protocole optimisé appliquant LCM couplée à une analyse de LC/MS (LCM-LC/MS) afin de quantifier les antituberculeux dans les compartiments distincts de granulome. Dans le processus de microdissection laser capture, un laser UV vise à travers l’objectif de microscope sur la section de tissu, ce qui coupe et d’isole la zone de tissu désiré en suivant un tracé défini par l’utilisateur. Pour l’assistance gravitationnelle LCM (la technique utilisée pour cette étude), la section de tissu est montée sur une lame de membrane mince polymère (PET ou stylo) et le tissu est capturé dans un bouchon de tube de collection situé en bas de la diapositive. Les médicaments sont extraits des tissus excisés et quantifiées à l’aide des procédures types de LC/MS. La quantité de tissu nécessaire à recueillir est finalement déterminée de la concentration attendue du médicament présent dans le tissu et la sensibilité de la méthode LC/MS. Aire de la surface est suffisante pour la plupart des analyses de drogues dosé à des niveaux thérapeutiques et analysées à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire triple systématique, 3 millions µm2 (2de 3 mm) de tissu.
Ce protocole décrit la combinaison puissante de profilage spatiale et quantification complet offert par LCM-LC/MS, fournissant des concentrations du médicament absolue dans tous les compartiments des granulomes de TB. La technique peut également être appliquée à la détermination des concentrations du médicament dans de nombreux tissus malades différents fournissant des informations de découverte et le développement de médicaments vitaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Résolue spatialement quantification des médicaments au sein des lésions pulmonaires de TB est nécessaire pour déterminer si l’exposition au médicament atteint stérilisant les concentrations de populations bactériennes qui résident dans les compartiments de différentes lésions. La méthode de LCM-LC/MS décrite ici permet une quantification absolue de médicaments antituberculeux dans tous les compartiments de la lésion, y compris le caseum riche en bactéries, en utilisant uniquement des sections de tissu 1…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Paul O’Brien, Marizel Mina et Isabella Freedman pour l’expérimentation animale, Jacquie Gonzalez et Danielle Weiner de NIH/NIAID aide avec irradiation gamma de tissus de lapin avant laser microdissection de saisie et de Jansy Sarathy manuscrit idées et conseils. Ce travail a été financé par la Bill et Melinda Gates Foundation (OPP1174780) et l’instrumentation de NIH partagé accordent 1S10OD018072. Nous remercions Eliseo A. eugénine donnant accès au microscope Leica LMD 6500 et le partage des compétences et des conseils. L’achat et soutien continu, les 6500 LMD a été financé par subvention du National Institute of Mental Health, MH096625, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NS105584, IRSP (à E.A.E) et de contributions de GSK (à E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
Riferimenti
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