レーザーによる肺の結核病変における薬物の空間の定量化をキャプチャ レーザーマイクロダイ セクション液体クロマトグラフィー質量分析法 (LCM-LC/MS)
Summary
ここでは、結核の肉芽腫内の薬剤分布の定量化が空間的に LC/MS 分析と相まってマイクロダイゼクション キャプチャを使用してプロトコルについて述べる。アプローチは高い空間の詳細で組織内の薬物濃度を定量化する幅広い適用性。
Abstract
結核はまだ罹患率と死亡率の世界の主要な原因であります。既存の薬物療法への改善と新規治療法の開発が緊急に必要です。成功した治療的介入に到達し、悪い血管壊死領域内 (caseum) 肺肉芽腫の細菌を滅菌する投与の結核薬の能力は欠かせません。効果的な化学療法従って有利な caseum の浸透性薬剤を含める必要があります。生体内薬物レベルを定量化するため現在の LC/MS メソッドの内で見られるよう小さな組織コンパートメント内にある絶対薬物濃度を正確に決定するが難しく、空間分解能機能が制限します。壊死性肉芽腫。病理学的個別組織領域のレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を組み合わせて LC/MS 定量化のプロトコルをご紹介します。この手法は肉芽腫 caseum、周辺細胞の病変と関与しない肺組織内で薬の絶対定量を提供し、したがって、正確に殺菌濃度が達成されているかどうかを判断します。結核研究に加えて技術罹病組織における薬の空間分布の定量化のための多くの潜在的なアプリケーションには。
Introduction
空間的解決および薬剤のレベルを定量化する能力は、抗結核薬殺菌濃度1で肺の病変内細菌集団に達するかどうかを決定するための重要な要件です。特に重要なは通常細菌の最大数が含まれていますし、悪い血管新生の不在のための薬にアクセスできること (呼ばれる caseum) 部位、壊死性コアに麻薬浸透を決定です。
切除肺の病変の均質化を伴う病変の浸透を評価するために伝統的な方法溶媒抽出と液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC/MS) の分析に続いて、高選択性の薬剤のため関心します。ただし、これらのメソッドは、貧しい空間については、元の均質化組織のサイズに制限を提供しています。エレクトロ スプレー イオン化 (デジ)4または液体が強化された表面抽出5、質量分析を用いたイメージング技術、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)2,3などが脱離します。 6高空間分解イメージング機能を提供するが、直接定量は非常に挑戦的なまたは異種イオン抑制効果と様々 な細胞から試料の異なる抽出効率のために不可能することができますまたは、組織の7種類します。また、最も直接組織 MS イメージング技術は本質的にイオン化し、組織から薬物の低い溶媒抽出効率を奪い合う内因性種のクロマト グラフ分離の不足のための液体クロマトグラフィー/質量よりも敏感です。
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) 液体クロマトグラフィー/質量分析と組み合わせるが日常的に分離し、異なる組織領域を特徴づけるプロテオーム研究8,9に適用されており、最近薬の定量化のために利用で投与動物組織10。ここで明確な肉芽腫コンパートメント内にある抗結核薬を定量化する LCM (LCM-LC/MS) の液体クロマトグラフィー/質量分析と組み合わせるを適用した最適化されたプロトコルを提案する.レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション処理で紫外線レーザー焦点カットし、ユーザーが定義したパスに従うことによって目的の組織領域を分離する組織切片上に対物レンズ。重力アシスト LCM (本研究の要素技術) のティッシュ セクションは高分子薄膜の膜スライド (ペットまたはペン) にマウントされ、組織がスライドの下に配置されているコレクション チューブ キャップでキャプチャされます。薬を摘出組織から抽出し、標準の LC/MS のアプローチを用いて定量化.収集するために必要な組織の量は、予想される組織内に存在の薬物濃度と LC/MS 法の感度から最終的に決定されます。薬物治療上のレベルで投与を行い, 組織のルーチンのトリプル四重極質量分析計、300 万 μ m2 (3 mm2) を使用して多くの解析面積で十分です。
このプロトコルを記述する空間プロファイルの強力な組み合わせとにおける定量化提供 LCM-LC/MS による結核の肉芽腫のすべてのコンパートメント内にある絶対薬物濃度を提供します。技術は、重要な薬の発見と開発の情報を提供する多くの異なる病気にかかったティッシュで薬物濃度を決定するのにも適用可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
肺の結核病巣内薬剤の空間分解の定量化は、薬曝露異なる病変コンパートメント内に存在する細菌の集団に殺菌濃度に達するかどうかを決定する必要があります。ここで説明した LCM LC/MS メソッドには、合計だけ 1-3 切片を使用して細菌の豊富な caseum を含むすべての病変のコンパートメント内にある抗結核薬の絶対定量ができます。伝統的な組織の均質化、しばしば体内薬物定量化の LC/MS 方…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿のレーザーマイクロダイ キャプチャおよび Jansy Sarathy 前にウサギの組織の γ 線照射と助け、ポール o ‘ brien、Marizel ミナと動物実験のイザベラ ・自由民権、ジャ ・ ゴンザレスと NIH/NIAID からダニエル Weiner に感謝します。考えやアドバイス。この作品は、ビルからの資金によって支えられた、メリンダ ・ ゲイツ財団 (OPP1174780) と共有 NIH 計装 1S10OD018072 を付与します。ありがとう Eliseo A. Eugenin ライカ LMD 6500 顕微鏡へのアクセスを提供し、専門知識やアドバイスを共有します。購入・継続的な支援、LMD 6500 国立精神衛生研究所の助成金、MH096625、国立神経疾患と脳卒中、NS105584、運輸 (E.A.E) への資金と (E.A.E) に GSK 貢献によって資金を供給されました。
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
Riferimenti
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